Nitrit-, Nitrat- und N 2 O-Reduktase in Starterorganismen für die Rohwurstreifung:
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| adam_text | Titel: Nitrit-, Nitrat- und N 2 O-Reduktase in Starterorganismen für die Rohwurstreifung
Autor: Schilcher-Gerlach, Sabina
Jahr: 2000
I. Inhaltsverzeichnis
I. Inhaltsverzeichnis I
II. Abkürzungsverzeichnis V
1. EINLEITUNG 1
1.1. Denitrifikation 1
1.2. Stickstoff-Kreislauf 3
1.3. Ökologische Aspekte der Denitrifikation 3
1.4. Die Bedeutung von Nitrat und Nitrit in der Lebensmittelproduktion 5
1.5. Starterkulturen 8
1.6. Möglichkeiten der genetischen Verbesserung von Starterkulturen 9
1.7. Enzyme der Denitrifikation 9
1.7.1. Nitratreduktase 10
1.7.2. Nitritreduktase 11
1.7.3. NO-Reduktase 12
1.7.4. N2O-Reduktase 13
1.8. Regulation der Denitrifikations-Gene 13
1.9. Problemstellung der Arbeit 14
2. MATERIAL UND METHODEN 16
2.1. Verwendete Mikroorganismen 16
2.1.1. Transformationsstämme 16
2.2. Verwendete Vektoren 17
2.3. Kulturmedien 17
2.3.1. MRS-Medium zur Anzucht von Laktobazilien (de Man et al., 1960) 17
2.3.2. LB-Medium für £. co//(Luria-Bertani) 18
2.3.3. Micrococcen-Medium 18
2.3.4. SOB-Medium (Hanahan, 1983) 18
2.3.5. SOC-Medium(Sambrooketal., 1989) 18
2.4. Häufig verwendete Lösungen 19
2.4.1. Ampicillin Stammlösung: 19
2.4.2. Ethidiumbromid-Färbebad (0,5 ug/ml): 19
2.4.3. 20xSSC: 19
2.4.4. TE-Puffer (8,0) 19
2.5. Stammhaltung 19
2.6. Isolierung von chromosomater- oder Plasmid-DNA
aus Laktobazilien 20
2.7. Alkalische Extraktion von Plasmid-DNA aus E. coli
nach Bimboim Doly, 1979 (modifiziert) 21
2.8. Plasmidisolierung mit Qiagen-Säulen 21
2.9. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA 22
2.9.1. Photometrisch 22
2.9.2 Getelektrophoretisch 22
2.10. DNA-Auftrennung über Agarose-Getetektrophorese (AGE) 22
2.10.1. Benötigte Lösungen 23
I. Inhaltsverzeichnis
2.10.2. Gelherstellung (Sambrook et al., 1989) 23
2.10.3. Gellauf 23
2.10.4. Detektion und Dokumentation 24
2.11. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 24
2.11.1. Membranfiltration nach Aufschmelzen und
Schockgefrieren des Agarosegels 24
2.11.2. Säulenchromatographie mit Qiagen-Gelextraktionskit 25
2.12. Hydrolyse der DNA mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen 25
2.13. Dephosphorylierung von DNA-Molekülen mittels
alkalischer Phosphatase 25
2.14. Verknüpfung von DNA- Molekülen mit der
T4-DNA-Ligase (Weiss et al., 1968) 26
2.15. Herstellung chemisch kompetenter Zellen (£. coli) 27
2.15.1. Verwendete Lösungen 27
2.15.2. Durchführung 28
2.16. Herstellung elektrokompetenter Zellen (E. coli)
modifiziert nach Dower et al., 1988 29
2.17. Transformation von E. coli (Hanahan, 1983) 30
2.18. Elektroporation (Dower et al., 1988) 31
2.18.1. Geräte und Elektroporationsparameter 31
2.19. DNA-Transfer auf positiv geladene Nylonmembran 32
2.19.1. Durchführung des Vakuumblots 32
2.20. Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden mit Hilfe von
random-priming (DIG-DNA-Labeling Kit, Boehringer) 33
2.21. Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden mit Hilfe von PCR 33
2.22. Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden mit
Hilfe von 3-endlabeling 35
2.23. DNA/DNA Hybridisierung 35
2.24. Koloniehybridisierung 36
2.25. Detektion der Digoxigenin-markierten Sonden 37
2.25.1. Chemolumineszenz-Detektion 37
2.25.2. Colorimetrische Detektion mit NBT und X-Phosphat 37
2.26. DNA-Sequenzierung (nach Sanger et al., 1977) 38
2.26.1. Direktsequenzierung von PCR-Amplifikaten 39
2.27. Erstellung einer Cosmid-Genbank 40
2.28. SDS-Poiyacryiamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 41
2.29. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 43
2.30. Colorimetrische Nitratbestimmung (Cataldo et al. 1975) 46
2.31. Colorimetrische Nitritbestimmung 47
2.32. Proteinbestimmung nach Lowry et ai. (1951) 48
2.33. Gaschromatographische Messungen 4-9
2.33.1. Gaschromatographische Messungen von N2O 5°
2.33.2. Gaschromatographische Messung von N2 und O2 51
I. Inhaltsverzeichnis
3. ERGEBNISSE 53
3.1. Gaschromatographische Messungen 53
3.2. PCR-Amplifikate 59
3.2.1. narG 64
3.2.2. naiH 64
3.2.3. nirS 64
3.2.4. nosZ 64
3.3. Hybridisierungs- und Klonierungsexperimente 65
3.3.1. Homologien zu narG 97
3.3.2. Homologien zu nirS 97
3.4. Sequenzierungen 98
3.4.1. Direktsequenzierungen von PCR-Amplifikaten 98
3.4.2. Sequenzierung von klonierten Genfragmenten 100
3.5. Physiologische Untersuchungen 101
3.6. Proteingele 104
4. DISKUSSION 106
4.1. Diskussion der eingesetzten Methoden 108
4.1.1. PCR-Amplifikationen (3.2. Abb. 9-13) 108
4.1.2. Hybridisierungsexperimente (3.3. Abb. 14-50) 108
4.1.3. Physiologische Untersuchungen 109
4.1.4. Klonierungsexperimente 111
4.1.5. Sequenzanalyse 112
4.2. Nitratreduktase (narG, narH) 112
4.2.1. Lactobacillus plantarum (TMW 1.64) 112
4.2.2. Lactobacillus farciminis {TMVJ 1.196) 112
4.2.3. Staphylococcus camosus (TMW 2.145, 2.146) 113
4.2.4. Lactobacillus buc/wieri (TMW 1.75) 113
4.2.5. Lactobacillus sakei (TMW 1.22,1.46) 113
4.2.6 Micrococcus varians (TMW 2.147, 2.148) 113
4.2.7. Lactobacillus pentosus (TMW 1.10) 113
4.2.8. Pediococcus pentosaceus (TMW 2.149) 113
4.3. Nitritreduktase (nirS, nirK) 114
4.3.1. Lactobacillus farciminis (TWiN 1.196) 114
4.3.2. Staphylococcus camosus (TMW 2.145, 2.146) 114
4.3.3. Lactobacillus buchneri (TMW 1.75) 115
4.3.4. Lactobacillus sakei (TMW 1.22,1.46) 115
4.3.5. Lactobacillus plantarum (TMW 1.64) 115
4.3.6. Micrococcus varians 115
4.3.7. Lactobacillus pentosus 115
4.3.8. Pediococcus pentosaceus 116
4.3.9. Klon 43 116
4.4. N2O-Reduktase (nosZ) 118
IV 1. Inhaltsverzeichnis
5. ZUSAMMENFASSUNG 119
6. LITERATURVERZEICHNIS 120
7. ANHANG 133
Klonierungs- und TranskriptionsvektorpSP72 (Prot nega) 133
Regressionsgerade N2 und O2 134
Homologie von Klon 43 aus P.pentosaceus TMW; 2.149
zu Carbamoyl-P-synthase-glutaminase-Gen vom L. plantarum 134
Eichgerade N2O 135
Eichgerade Acetylen 135
Danksagung
Lebenslauf
|
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