Massenspektrometrische, proteinchemische und pharmakologische Charakterisierung der aminoterminalen Domäne des Corticotropin-Releasing-Faktor-Rezeptor 1 aus Ratte:
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Göttingen
Cuvillier
2000
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis V
Tabellenverzeichnis VII
Symbole und Abkürzungen VIII
1. EINLEITUNG 1
1.1 Das neuroendokrine System 1
1.1.1 Corticotropin Releasing Faktor im neuroendokrinen System 3
1.1.2 Wirkungen von Corticotropin Releasing Faktor und seinen Analoga 5
1.1.3 Corticotropin Releasing Faktor bindende Proteine 8
1.1.4 Proteinchemische Charakterisierung von Peptidrezeptoren 12
1.2 Bioanalytische Massenspektrometrie 13
1.2.1 Ionisationsmethoden 13
1.2.2 ES Massenspektrometrische Charakterisierung von Proteinstrukturen 17
1.3 Aufgabenstellung 19
2. ERGEBNISSE 21
2.1 Überexpression und Reinigung von rCRFRl NT 21
2.1.1 Transfektion der HEK 293 Zellen 21
2.1.2 Optimierung der rCRFRl NT Expression durch Variation der serumfreien Medien
23
2.1.3 Expression von rCRFRl NT in Gegenwart von Kifunensine 27
2.1.4 Isolierung von rCRFRl NT bzw. rCRFRl NT Kif 30
2.2 Überexpression von rCRFRl in HEK 293 Zellen 32
2.3 Pharmakologische Charakterisierung von rCRFRl und rCRFRl NT 34
2.3.1 Bindungsstudien mit rCRFRl und rCRFRl NT 34
2.3.2 Agonisten induzierte cAMP Akkumulation 39
2.4 Strukturelle Charakterisierung von rCRFRl NT Kif und rCRFRl NT 40
2.4.1 Charakterisierung der Primärstruktur 40
2.4.2 Charakterisierung der Disulfidbrilckenstruktur 47
I
II Inhaltsverzeichnis
2.4.3 Charakterisierung der Glycosylierungsstruktur 55
3. DISKUSSION 64
3.1 Eukaryotische Überexpression von rCRFRl NT 64
3.1.1 Überexpression in serumfreien Medien 54
3.1.2 Überexpression in Gegenwart des Mannosidase Mnhibitors Kifunensine 65
3.2 Einfluß des Glycosylierungstyps auf die Funktionalität von rCRFRl 68
3.2.1 Glycosylierungstypen von rCRFRl und rCRFRl Kif 68
3.2.2 Einfluß des Glycosylierungstyps auf die Affinitätskonstanten von rCRFRl 70
3.2.3 Einfluß des Glycosylierungstyps auf die Agonisten induzierte cAMP
Akkumulation 72
3.3 Pharmakologische Charakteristika von rCRFRl NT Kif 73
3.4 Posttranslationale Modifikationen von rCRFRl NT Kif und rCRFRl NT 75
3.4.1 Aminoterminale Prozessierung 75
3.4.2 Glycosylierungstyp 7g
3.4.3 Glycosylierungsstellen 77
3.4.4 Disulfidbruckenstruktur 79
4. ZUSAMMENFASSUNG 83
5. AUSBLICK 6. MATERIAL UND METHODEN 87
6.1 Chemikalien g7
6.2 Geräte a8
OÖ
6.3 Eukaryotische Zellkultur fffi
00
6.3.1 Allgemeines sfi
so
6.3.1.1 Steriles Arbeiten gg
6.3.1.2 Zentrifugation von Zellen g9
6.3.1.3 Mikroskopie go
6.3.1.4 Bestimmung der Lebendzellzahl 89
6.3.2 Kultivierung der HEK 293 Zellen 89
Inhaltsverzeichnis III
6.3.3 Einfrieren der HEK 293 Zellen 90
6.3.4 Auftauen der HEK 293 Zellen 90
6.3.5 Passagieren der HEK 293 Zellen 91
6.3.6 Membranpräparation aus HEK 293 Zellen 91
6.3.7 Transfektion von HEK 293 Zellen 92
6.3.8 Serumfreie Medien für HEK 293 Zellen 92
6.3.9 Expression von rCRFRl NT in HEK 293 Zellen 94
6.3.10 Inhibierung der Mannosidasel in HEK 293 Zellen 95
6.4 Bindungsstudien mit rCRFRl und rCRFRl NT 95
6.5 Messung der Agonisten induzierten cAMP Produktion 96
6.6 Proteinchemische Experimente 97
6.6.1 Proteinkonzentrationsbestimmung 97
6.6.2 Diskontinuierliche SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS PAGE) 98
6.6.3 Proteintransfer aus Polyacrylamidgelen auf PVDF Membranen (Western Blot).. 100
6.6.4 Proteinfärbung 100
6.6.5 Immunologische Detektion von Proteinen auf PVDF Membranen mittels
Chemoluminiszenz 101
6.6.6 Lektinologische Detektion von Glycoproteinen auf PVDF Membranen 103
6.6.7 Deglycosylierungen 104
6.6.7.1 Enzymatische Deglycosylierung von Membranproteinen 105
6.6.7.2 Enzymatische Deglycosylierung von rCRFRl NT 105
6.6.8 Proteinreinigung über Nickelaffinitätschromatographie 106
6.6.9 Reduktion und Derivatisierung von rCRFRl NT 107
6.6.10 Enzymatische Spaltung von rCRFRl NT 108
6.6.10.1 Endoprotease Trypsin 108
6.6.10.2 Endoprotease AspN 109
6.6.11 Peptidsequenzierung durch automatisierten Edman Abbau 109
6.7 Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP HPLC) 110
6.7.1 Semipräparative RP HPLC 110
6.7.2 Analytische RP HPLC 110
6.8 Massenspektrometrie , 111
7. LITERATURVERZEICHNIS 114
IV Inhaltsverzeichnis
ANHANG 1 129
ANHANG II 130
ANHANG III , 133
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