Einfluß von Tanninen in Eichenblättern auf die Wirksamkeit von B. thuringiensis gegenüber Schwammspinner, Lymantria dispar, L. Lymantriidae:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1997
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Getr. Zählung graph. Darst. |
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| adam_text | Titel: Einfluß von Tanninen in Eichenblättern auf die Wirksamkeit von B. thuringiensis gegenüber Schwamm
Autor: Hartl, Franz-Josef
Jahr: 1997
I
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
I.t Das Bakterium 1
1.2 Tannine 3
2 MATERIAL UND METHODEN 5
2.1 Zucht von L. dispar 5
2.1.1 Herkunft des Zuchtmaterials 5
2.1.2 Allgemeine Zuchtbedingungen 6
2.1.3 Vorbehandlung der Eigelege nach der Diapause 6
2.1.4 Larvenaufzucht und Futter 6
2.1.5 Eiablage 7
2.1.6 Diapause und Kältebehandlung 7
2.2 Entwicklungserfoig in der Dauerzucht 8
2.2.1 Futterarten 9
2.2.2 Bedeutung der Larvendichte pro Futterbox 10
2.2.3 Position der Eier im Gelege und Entwicklungserfolg 10
2.2.4 Puppengewichte der Tochtergenerationen 11
23 Technik der Bioassavs 11
2.3.1 Vereuchslarven 11
2.3.2 Verfahren zur Applikation einer definierten Dosis B. thuringiensis 12
2.3.2.1 Applikation über einen lOul Tropfen Kunstdiät 12
2.3.2.2 Applikation über ein lmnr großes Oblatenstück 12
2.3.2.3 Applikation als 0,5 nl Tropfen auf die Mundwerkzeuge der Larven 13
2.4 Extraktion von Tanninen aus Eichenblärtern 13
2.4.1 Blattmaterial 13
2.4.1.1 Eichenart 14
2.4.1.2 Auswahl der Bäume und Blartemte 14
..4.1,3 Herstellung von Blattmehl 15
II
Inhaltsverzeichnis
2.5 Fraktionierung des Rohextraktes 17
2.5.1 Präparative Fraktionierung an Sephadex LH-20 17
2.5.2 Fraktionierung des Rohextraktes mit HPLC i8
2.6 Charakterisierung der Fraktionen des Tanninrohextraktes 20
2.6.1 Kolorimetrische Verfahren zur Tanninbestimmung 20
2.6.1.1 UV-Test 21
2.6.1.2 Folin-Test 21
2.6.1.3 Porter-Test
23
2.6.1.4 Rhodanin-Test 25
2.6.2 Chromatographische Verfahren (HPLC) 27
2.6.3 Aminosäurenbestimmung 2°
2.6.4 Glucosebestimmung 2
2.6.5 Gaschromatographische Analyse
2.6.5.1 Prinzip der Gaschromatographie 30
2.6.5.2 Probenvorbereitung 3
2.7 Proteasen von i. dispar
2.7.1 Gewinnung der L dispar Proteasen
2.7.2 Aktivierung von B. thuringiensis durch Proteasen von L dispar
2J) Einfluß der Sephadex LH-20 Tanninfraktionen auf Proteasen und die
Wirkung von B. thuringitnsis ^5
2.8.1 Trypsin und Tannine der Sephadex LH-20 Fraktionen 36
2.8.1.1 Allgemeine Parameter der Enzymreaktion Trypsin/BAPNA ^
2.8.1.1.1 pH-Wert 37
2.8.1.1.2 Substratsattigung 3S
2.8.1.1.3 Enzymkonzenrration ^
2.8.1.2 Parameter für den Einfluß von Tanninen auf die Enzymreaktion Trypsin/BAPNA 39
2.8.1.2.1 Reaktionszeit 39
2.8.1.2.2 Anteil der Tannine im Tannin/Trypsin Gemisch ¦
2.8.1.3 Einfluß der SephadexLH-20 Fraktionen auf tue Enzymreaktion Trypsin/BAPNA *
2.8.2 Proteasen von L dispar und Tannine der Sephadex LH-20 Fraktionen 40
2.8.2.1 Optimierung der Enzymreakrion L. dispar-Proteasen/BAPNA 40
2.8.22 Charakterisierung der L. dispar Proteasen 4
2.8.2.2.1 pH-Wert 42
2.8.2.2.2 Aktivität und Proteingehalt 42
HI
Inhaltsverzeichnis
2.8.2.3 Reaktionszeit von Tanninen und Proteasen von L. dispar 42
2.8.2.4 Einfluß der Sephadex LH-20 Fraktionen auf die L. dispar Proteasen/BAPNA Reaktion 43
2.8.3 Tannine der Sephadex LH-20 Fraktionen und B. thuringiensis 43
2.8.3.1 Zeitlich getrennte Applikation von Tanninen der Sephadex LH-20 Fraktionen und
B. thuringiensis 44
2.8.3.2 Gemeinsame Applikation von B. thuringiensis und Tanninen der Sephadex LH-20 Fraktionen 45
2.9 Protein-Tannin-Interaktionen von Einzelsubstanzen 46
2.9.1 Bindung der Tannine von Eichenblättem an Proteasen von L dispar 46
2.9.1.1 Vorüberlegungen 46
2.9.1.1.1 Affinität einzelner HPLC-Fraktionen zu Proteasen von L. dispar 47
2.9.1.1.2 Konkurrenzfaktor einzelner HPLC-Fraktionen gegenüber Proteasen von L. dispar 48
2.9.1.1.3 Hemmung der Proteasen von L. dispar von Eichenblattanninen 48
2.9.1.1.4 Mögliche Einflüsse auf die Hemmung der Proteasen 51
2.9.1.2 Versuchsansätze zur Bestimmung der Proteasen-Tannin-Imeraktion 51
2.9.2 Bindung der HPLC-Fraktionen an Endotoxin/Toxin von B. thuringiensis 53
2.9.2.1 Gewinnung von B. thuringiensis Endotoxia 55
2.9.2.2 Affinität von Tanninen zu Toxin und Endotoxin bei verschiedenen Proteinkonzentrarionen 55
2.9.2.3 Affinität von Tanninen zu nicht aktiviertem Endotoxin 56
2.9.2.4 Affinität der Tannine gegenüber Toxin 56
2.10 Bioassays mit B. tkuringiensis und einzelnen HPLC-Fraktionen 57
2.10.1 Auswahl der einzelnen HPLC-Fraktionen 57
2.10.2 Charakterisierung ausgewählter HPLC-Tanninfraktionen durch Messung des Extinlcrionsmaximums 58
2.10.3 Durchführung der Bioassays 58
2.10.4 Bioassays mit verschiedenen Mengen an HPLC-Tanninfraktionen 59
2.11 Änderung der phenolischen Inhalostoffe im Jahresgang 69
2.12 Statistik 61
3 ERGEBNISSE 64
3.1 Entwicklungserfolg der Zucht 64
3.1.1 Einflufl des Futters 64
3.1.2 Die Bedeutung der Larvendichte im Zuchtbehilter 66
3.1.3 Einfluß der Position der Eier im Gelege auf den Entwickiungserfoig * 67
3.1.4 Puppengewichte der Tochtergenerarionen 69
IV
Inhaltsverzeichnis
3.2 Vorversuche zur Applikation von B. thuringiensis an L. dispar 70
3.2.1 Applikation in einem lOfal Tropfen Kunstdiät 70
3.2.2 Applikation mit einem lmm2 großen Oblatenstück 72
3.2.3 Applikation als 0,5 i Tropfen auf die Mundwerkzeuge der Larven 72
33 Aktivierung des B. thuringiensis Toxins durch L dispar Proteasen 73
3.3.1 Auswirkung der Aktivierung auf die Mortalität 73
3.3.2 Auswirkung der Aktivierung auf das Larvengewicht 75
3.3.3 Auswirkung der Aktivierung auf die k-Werte 7
3.4 Einfluß des Extraktionsverfahrens auf die Tanninausbeute 80
3.5 Fraktionen der säulenchromatographischen Trennung an Sephadex LH-20 *4
3.5.1 Definition und photometrische Charakterisierung der Sephadex LH-20 Fraktionen 84
3.5.2 Charakterisierung der Sephadex LH- 20 Fraktionen mit HPLC 90
3.5.2.1 Detektion mit 280 nm (Kanal 1) 9°
3.5.2.2 Detektion mit 640 nm (Kanal 2) nach Derivatisierung mit DMACA 3
3.5.3 Überblick: Einrotierte Sephadex LH-20 Fraktionen 96
3.6 Proteasen und Sephadex LH- 20 Fraktionen 97
3.6.1 Trypsin und Sephadex LH- 20 Fraktionen 97
3.6.1.1 Optimale Meßparameter der Aktivitätsbestimmung von Trypsin °
3.6.1.2 Bestimmung der optimalen Meßparameter zur Messung des Einflusses von Tanninen auf die
Enzymreaktion von Trypsin/BAPNA ™
3.6.1.3 Einfluß der Aceton-Fraktionen auf die Trypsin/BAPNA Reaktion 102
3.6.2 Proteasen von L. dispar und Sephadex LH- 20 Fraktionen !03
3.6.2.1 Optimierung der Meßparameter der L fcpor-Proteasen/BAPNA Reaktion 104
3.6.2.1.1 Bestimmung des pH-Optimums ^
3.6.2.1.2 Einfluß der Substratsättigung auf die L. dispar Proteasen/BAPNA Reaktion I05
3.6.2.1.3 Einfluß der Enzymkonzentration auf die L. dispar Proteasen/BAPNA Reaktion 105
3.6.2.2 Charakterisierung der L dispar Proteasen 106
3.6.2.2.1 pH-Wert I07
3.6.2.2.2 Aktivität und Proteingehalt 107
3.6.2.3 Reaktionszeit von Tanninen mit L. dispar Proteasen 10S
3.6.2.4 Einfluß der Aceton-Fraktionen auf die L dispar- Proteasen/BAPNA Reaktion I09
V
Inhaltsverzeichnis
3.7 Einfluß der Sephadex LH-20 - Fraktionen auf die Wirksamkeit von B. thuringiensis 110
3.7.1 Einfluß von Aceton-Fraktionen im Futter auf die Larven von L. dispar 111
3.7.2 Einfluß der über das Futter aufgenommenen Aceton-Fraktionen auf die Wirksamkeit von B.
thuringiensis 113
3.7.3 Zeitgleiche Applikation von B. thuringiensis und Aceton-Fraktionen 114
3.8 Definition und Fraktionierung einzelner Tannine mittels HPLC 117
3.9 Charakterisierung der einzelnen HPLC -Friktionen 120
3.10 HPIt -Fraktionen und Proteasen von L. dispar 123
3.10.1 Affinität und Konkurrenzfaktor der HPLC-Fraktionen 124
3.10.2 Affinität und Konkurrenzfähigkeit - Korrelationen mit photometrisch bestimmbaren Eigenschaften 130
3.10.3 Hemmung der Proteasen von L. dispar durch Eichblattannine 134
3.10.3.1 Absolute Aktivitätshemmung 135
3.10.3.2 Relative Aktivitatshemmung - Effizienz einer hemmenden Substanz 137
3.10.4 Charakteristika der HPLC-Fraktionen und Proteasenaktivität 141
3.10.4.1 Photometrisch bestimmte Eigenschaften der HPLC-Fraktionen 142
3.10.4.2 Menge der an Darmproteasen gebundenen Peakfläche (^Maskierung) 145
3.10.4.3 Affinität und Konkurrenzfaktor der HPLC-Fraktionen 147
3.11 Tannine von Eichenblättern und EndotoxinToiin von B. thuringiensis ISO
3.11.1 Affinität und Konkurrenzfaktor der HPLC-Fraktionen zu einem Toxin/Endotoxin-Gemisch 150
..11,2 Affinität und Konkurrenzfähigkeit gegenüber dem Toxin/Endotoxin-Gemisch - Korrelationen mit
photometrisch bestimmbaren Eigenschaften 156
3.11.3 Affinität von Tanninen zu Endotoxin und Toxin 160
3.12 Bioissays mit einzelnen HPLC-Fraktionen IM
3.12.1 Auswahl der HPLC-Fraktionen und Charakterisierung durch ihr Extinktionsmaximum 164
3.12.2 Einflufl der HPLC-Fraktionen auf die Wirksamkeit von B. thuringiensis 16g
3.12.2.1 Einfluß der HPLC-Fraktionen auf die Mortalität 168
3.12.2.2 Einflufl der HPLC-Frakrion auf die Larvengewichte 173
3.12.2.3 Einfluß der HPLC-Fraktion auf die k-Werte 181
3.12.3 B. thuringiensis stark hemmende Verbindungen bei verschiedenen Konzentrationen 186
3.12.3.1 HPLC-Fraktion66Mmuten 188
3.12.3.1.1 Einfluß der HPLC-Fraktion 66 min. auf die Mortalität bei Infektion mit 7,5 IU 188
3.123.1.2 Einflufl der HPLC-Fraktion 66 min auf die Larvengewichte bei Infektion mit 7,5 IU 189
3.12.3.1.3 Einfluß der HPLC-Fraktion 66 min. auf die k-Werte bei Infektion mit 7,5 IU • 191
VI
Inhaltsverzeichnis
3.12.3.2 HPLC-Fraktion 240 Minuten 193
3.12.3.2.1 Einfluß der HPLC-Fraktion auf die Mortalität bei Infektion mit 7,5 oder 16 IU 193
3.12.3.2.2 Einfluß der HPLC-Fraktion auf die Larvengewichte bei Infektion mit 7,5 oder 16 IU 195
3.12.3.2.3 Einfluß der HPLC-Fraktion auf die k-Werte bei Infektion mit 7,5 oder 16 IU 197
3.12.3.3 Zusammenfassung
3.13 Wirksame HPLC-Frakttonen und Ihre chemisch analytischen Eigenschaften 205
3.14 Änderung der phenoUschen Inhaltsstofle Im Jahresgang 208
4 DISKUSSION 2
4.1 Zucht 214
4.2 Position der Eier im Gelege und Entwicklungserfolg 215
43 Extraktionsvorbereitung und Lagerung der Elchenblltter 216
4.4 Extraktionsverfahren 217
4.5 Photometritche Verfahren zur Bestimmung der Gehalte an kondensierten Tanninen 218
4.6 Tannlne und Proteine 219
4.7 Applikation von B. thuringitnsis und Tanninen 224
4.S Tannine und die Wirkung von thuringiensk 228
4.8.! Tannine und Proteasen von L dispar - Bedeutung für die Wirksamkeit von B, thuringiensis 231
4.8.2 SindungiaHPLC-Fraknonen an Endotoxin und Toxin von B. thuringiensis 237
4.8.2.1 Endotoxm 237
4.8.2.2 Toxin 239
4.8.3 Zusammenschau 240
4.9 Saisonale Veränderungen der Tanningehalte 242
5 ZUSAMMENFASSUNG 243
6 LITERATURVERZEICHNIS 246
7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 26!
8TABEUJENVERZBCHNIS 268
I
Abbildungsverzeichnis
7 Abbildungsverzeichnis
Abb. l: Schema zur Extraktion von Tanninen als Eichenblättern..........................................................16
Abb. 2: Eichgerade Folin-Test bei hohen Tanninkonzentrationen, die Geradenfunktion und der r-
Wert der Regressionsgerade sind angegeben. Mesansatz: Tannin-Probe eingetrocknet (5hl
Tanninrohextrakt; 50 hl Sephadex-Fraktion) in 3,0 ml R.O bidest. und 2,0 ml 2% Na2CO, in
0,1 N NaOH MIT 0,1 ML FOUN ClOCALTEUS REAGENZ, BEI 750 NM PHOTOMETRIERT.................................22
Abb. 3: Eichgerade Folin-Test bei geringen Taxntnkonzentrationen. Die Geradenfunktion und
der r: wert der regressionsgerade sind angegeben. mebansatz: tannin-probe
eingetrocknet (hplc-fraktion aus 25fjl tanninrohextrakt) in j ,0 ml h^o bidest. und 0,75 ml
2% Na,CO, in 0,1 n NaOH mit 0,05 ml Folin Ciocalteus Reagenz; bei 750 nm photometriert.......23
Abb. 4: Eichgerade Porter-Test. Die Geradenfunktion und der r: Wert der Regressionsge-rade
SIND ANGEGEBEN. MöANSATZ: TANMN-PROBE EINGETROCKNET (5ftL TANNINROHEX-TRAKT; 50 |IL
Fraktion), 3,0 ml n-Butanol/Salzsäure 95/5 (v/v) und 0,1ml Eisenrea-genz (2%ige (w/v)
lösung elsenammoniumsulphat-dodecahydrat); bei 520 nm photometrieren..............................24
Abb. 5: Eichgerade Rhodanin-Test bei hohen Tanninkonzentrationen. Die Geradenfunktion und
der r2 Wert der Reoressionsgerade sind angegeben..........................................................................25
Abb. 6.: Eichgerade Rhodanin-Test bei geringen Tanninkonzentrationen. Die Geradenfunktton
und der r: -Wert der Regressionsgerade sind angegeben.................................................................26
abb. 7: hilfszeichnung- proteasenakttvität und verschieden starke relative hemmungen..............50
Abb. 8: Mortalitäten und Boxplots (Box=25% bis 75% Percentil mtt Mediän; Error bars=90%
pacentile; o95% percentile) der larvengewichte 9 tage nach erreichen des l3 stadiums
bei 50 Larven (n=400) und 75 Larven (n=200) pro aiTERBOx. Signifikante unterschiede sind
MIT UNTERSCHIEDLICHEN BUCHSTABEN GEKENNZEICHNET ( r=0,05; LARVENOEWICHTE: EINFAKTOR1ELLE
ANOVA; Mortalität: GLIM f. binomiale Fehler).................................................................................67
Abb. 9: Gesamtmortalität von L. dispak 6 Tage nach Infektion in Abhängigkeit von der B.
THUKINGfEKSlS DOSIS IN IU..
.71
Abb. 10: Mortalität von L. dispak bei verfütterung einer Dosis von 2IU B. wurinciessis, die zuvor
UNTERSCHIEDLICH LANGE MIT PROTEASEN AKTIVIERT WORDEN ET..............................................................74
Abb. 11: Entwicklung der Larvengewichte der überlebenden Larven, bei Applikation von 2 IU B.
THVR1NGIEKSIS, DAS UNTERSCHIEDLICH LANGE MIT PROTEASEN ^ AKTIVIERT WURDE. AM ENDE DER
EXPONENTIAL-REGRESSIONSORAPHEN IST DEREN a NKTION UND R -WERT ANGEGEBES............................77
Abb. 12: Verlauf der k-Werte bei Larvenkollektjven, die mit unterschieduch lange aktiviertem
b. thurlngtensls (2 iu) infiziert worden sind..........................................................................................79
Abb. 13 a, b: Fraktionierung der, mit den Extraktionsvarianten 1 bzw. 2 isolierten Tannin-
Rohextrakte AN SEPHAOEX LH-20, MIT EWEM DfSKONTtNüfflUJCHEN ACHTON/WASSER GRADIENTEN.. 8!
ABB. 14 A-D: FRAKTIONIERUNO DER TANNINROHEXTRAKTE (EXTRAXTIONSVARIANTE 2) AN SEPHADEX LH-20
mit bnem aceton/wasser gradienten. fortsetzung nächste seite.................................................85
Abb. 15: Gesamtglucose- und Gbamtgauxssäuregehalte in den Fraktionen der
tanwnrohextrakte(extraicnonsvariante2). 2. aufarbettung......................................................87
II
Abbildungsverzeichnis
Abb. 16 a - d: HPLC Trennung (A. = 280 nm) an einrotierten Aceton-Fraktionen der 2. Auf-
arbeitung nach fraktionierung an Sephadex LH-20. peaks, deren Fläche in einer aceton-
fraktion mindestens 80% der gesamtfläche (= summe der flächen aller peaks, der gleichen
Peakzuordnung in allen Aceton-Fraktionen) besitzen (charakteristische Peaks), sind mit
ihrer Zuordnungsnummer gekennzeichnet. Fortsetzung nächste Seite.......................................91
abb. 17 a - d: hplc trennung (x. = 640 nm) an einrotierten aceton-fraktionen der 2. aufar-
BEITUNG NACH FRAKTIONIERUNG AN SEPHADEX LH-20. PEAKS, DEREN FLÄCHE IN EINER ACETON-
FRAKTION MINDESTENS 80% DER GESAMTFLÄCHE (= SUMME DER FLÄCHEN, ALLER PEAKS, DER
GLEICHEN PEAKZUORDNUNG IN ALLEN ACETON-FRAKTIONEN) BESITZEN (CHARAKTERISTISCHE PEAKS),
sind mit ihrer Zuordnungsnummer gekennzeichnet...........................................................................95
Abb. 18: Gehalte an phenolischen Inhaltsstoffen in den gepoolten und eingeengten Aceton-
Fraktionen. Nach Trennung eines Tanninrohextraktes an Sephadex LH-20 mit einem
diskontinuierlichem acetongradienten...............................................................................................96
Abb. 19: Abhängigkeit der Trypsinakttvität (Mittelwerte; n=3) von dem pH-Wert im Mbjansatz.
meßansatz: 16,7 ngtrypsin/ml; 2,25 mg bapna...................................................................................98
Abb. 20: Abhängigkeit der Trypsinakttvttät (Mittelwerte; n=3) von der Substratkonzentration.
Mebansatz: 16,7|jgTrypsin/ml;pH8......................................................................................................99
Abb. 21: Abhängigkeit der Trypsinaktivität (Mittelwerte; n=3) von der Trypsinkonzentration.
Die Funktion der Regressionsgerade und das BESTIMMTHEITSMAß (R2) sind angegeben.
Mebansatz: 2,25 MG BAPNA; pH 8..........................................................................................................100
Abb. 22: Abhängigkeit der Reduzierung der TRypsiNAKTrvrrÄT durch Tanninrohextrakt von der
Dauer der Inkubation (Reaktionszeit). Mebansatz: 2,25 mg BAPNA; pH 8...................................101
Abb. 23: Reduzierung der Trypsinaktivität bei unterschiedlichen Anteilen des Tanninrohex-
traktes im Inkubationsansatz (Mittelwerti; n=3). Mebansatz: 2,25 mg BAPNA; pH 8...........102
.abb. 24: Mittelwert der Reduzierung der Trypsinaktivität durch die verschiedenen Aceton-
Fraktionen (n=2). In der 0-Probe ist statt Tannin Wasser mit Trypsin inkubiert worden.
Mesansatz: 2,25 MG BAPNA; PH 8..........................................................................................................103
Abb. 25: Aktivität (Mittelwerte, n=3) der Proteasen von L. dispar m Abhängigkeit vom pH-Wert.
Mebansatz: 25 hl Proteasen; 2.25 mg BAPNA.....................................................................................104
Abb. 26: AKTtvnÄT der L dispar Proteasen in Abhängigkeit von der Substratkonzentration (mg
BAPNA/ml MEßANSATZ), Mebansatz: 25 hl Proteasen; pH 10............................................................105
Abb. 27: Aktivität von l. dispam Proteasen in Abhängigkeit von deren Volumen im Mebansatz.
Mebansatz: 2.25 MG BAPNA; pH 10........................................................................................................106
Abb. 28: Zusammenhang von Proteingehalt und Proteasenaktivität des Proteasensekretes.
angegeben sind de Geradengleichungen und r 2-Werte der optimalen Regressions-gerade
(—) sowie der regressionsgerade durch den ursprung ( )..........................................................108
ABB. 29: ÄNDERUNG DER PrOTEASENAKTIVITÄT BEI INKUBATION MIT TANNINROHEXTRAKT IN ABHÄNGIGKEIT
von der Inkubationszeit (Reaktionszeit). Mebansatz: 2,25 mg BAPNA; pH 10.............................109
III
Abbildungsverzeichnis
Abb. 30: Mtttelwert (n=3) der Reduzierung der L. dispar Proteasenakttvität durch die
VERSCHIEDENEN ACETON-FRAKTIONEN, DER REINIGUNGSFRAKTION (50% MeOH) UND
Tanninrohextrakt. Die einzelnen Punkte sind der Mtitelwert aus 3 Wiederholungen. In der
O-Probe ist statt Tannin Wasser mit Proteasen inkubiert worden. Mebansatz: 2^5 mg
BAPNA;pH 10............................................................................................................................................II0
Abb. 31 a, b: Mortalitäten (a) und Boxplots (b) (Box=25% bis 75% Percentil mit Mediän; Error
bars=90% Percentile; O=95% Percentile) der Larvengewichte 3 Tage nach Erreichen des L3
Stadiums. Die Larven von L dispar hatten zuvor 9 Tage Standarddiät, die mit den genannten
ACETON-fllAKTIONEN VERSETZT WAR, GEFRESSEN. SIGNIFIKANTE UNTERSCHIEDE SIND MIT
UNTERSCHIEDLICHEN BUCHSTABEN GEKENNZEICHNET ( Z=0,05; LARVENGEWICHTE: EINFAKTORIELLE
ANOVA; Mortalität: GLIM f. binomial Fehler; n=150 pro Treatment).................................... 112
Abb. 32: Mortalität von L dispar Larven, die vor einer B. thuringiensis Applikation mit Tanninen
angereicherte standarddiät gefressen hatten. b. thuringiensis dosis: 5 iu/larve
Durchschnittliche Larvengewichte mit Standardabweichung vor Ver-suchsbeginn nach 36
Stunden ohne Nahrung. Signifikante Unterschiede bestehen, falls Buchstaben
unterschiedlich sind (a=0,05; larvengewichte und stunden: eem-faktorielle anova;
Mortalität: GLIM f. binomial Fehler; n= 100 pro Treatment)........................................................114
Abb. 33: Mortalitäten (nach 6 Tagen) von L. dispar nach Aufnahme von 5 10 B. thuringiensis, die
in verschiedenen einrotierten aceton-fraktionen sowie wasser als nullprobe inkubiert
waren. Durchschnittliche Larvengewichte mit Standardabweichung vor Versuchsbeginn,
nach 36 Stunden ohne Nahrung. Signifikante Unterschiede bestehen, falls beide
Buchstaben unterschiedlich sind (a=0,05: Larvengewichte und Stunden: einfaktorielle
ANOVA; Mortalität: GLIM F. binomial Fehler; n=60 pro Treatment)..........................................115
Abb. 34: HPLC-Chromatogramm (Kanal 1; 280 nm) des Rohextraktes von 2 Gramm Blattmehl in 5
ml. Die HPLC-Fraktionen, die ausgewählt (Kriterien: Fläche 100 mV min oder Höhe 100
mV) und genauer untersucht wurden, sind mit ihrer Elutionszeit gekennzeichnet.................120
Abb. 35: Peakflächen (mV*min) der HPLC-Fraktionen aus 25 hl Tanninrohextrakt (Mittelwerte;
n=3) bei detektion mit 280 nm. die hplc-fraktionen sind mit ihrer gerundeten elutionszert
bezeichnet..................................................................................................................................................121
Abb. 36: Ergebnisse des Foun-Tests (Mittelwerte; n=3) mtt den HPLC-Fraktionen aus 25 a.
Tanninrohextrakt. Die HPLC-Fraktionen sind mit ihrer gerundeten ELunoNSZErr bezeichnet. 122
Abb. 37: Ergebnisse des Porter- und Rhodanin-Tests (Mittelwerte; n=3) mit den HPLC-Fraktionen
aus 25 |iL Tanninrohextrakt. Die HPLC-Fraktionen sind mit ihrer gerundeten Elutionszeit
bezeichnet..................................................................................................................................................122
abb. 38: porter/folin und rhodanin/foun verhältnisse (mittelwerte; n=3) der hplc-fraktionen
aus 25 hl Tanninrohextrakt. Die HPLC-Fraktionen sind mtt ihrer gerundeten Elutionszeit
bezeichnet..................................................................................................................................................i23
Abb. 39: Summe (Balken) und prozentualer Anteil (Linie) der durch Inkubation von Tanninroh-
extrakt UND UNTERSCHIEDLICHEN PROTEINMENGEN IN FORM VON AUFKONZENTRIERTEN PROTEASEN
VONi. DISPAR REDUZIERTEN PEAKFLÄCHE (MITTELWERTE; N = 3)............................................................ 25
Abb. 40: Affinität der HPLC-Fraktionen bei PROTEiNüBERSCHue - Prozentuale Reduzierung der
PEAKFLÄCHE (MITTELWERTE; N 3) DURCH ZUGABE VON PROTEASENPROTEIN IM ÜBERSCHUB (5,64
MG/INKUBATIONSANSATZ)...........................................................................................................................12*
IV
Abbildungsverzeichnis
Abb. 41: Affinität als prozentuale Reduzieruno der Peakflächen und Konkurrenzfaktoren der
HPLC-Fraktionen bei Proteinmangel (Mittelwerte; n = 3). Die geringe Proteinmenge von 1,41
mg im inkubationsansatz limitierte die bindung (konkurrenzsituation)....................................128
Abb. 42: Affinität der HPLC-Fraktionen als prozentuale Reduzierung der Peakfläche in
proteasen bei proteinüberschuß oder proteinmangel im inkubationsansatz und
konkurrenzfaktor der hplc-fraktionen (in prozent-100% =1,0) in abhängigkeit von:......... 133
abb. 43: absolute aktivitätshemmung der hplc-fraktionen (mittelwerte; n=3). eine hplc-
fraktion aus 25 hl tanninrohextrakt (= 10 mg tg blattmehl) wurde mit 25 |*l proteasen 5
min. lang inkubiert. me0ansatz: 0,5 ml 0,4 m boratpuffer, ph 10; 0,875 ml h2o bidest, 0.1 ml
bapna in dimethylformamcd - 15 mg/ml; meöze1t: 2 min................................................................. 135
Abb. 44: verlauf der absoluten Aktivitätshemmung mit zunehemender Konzentration im
Inkubationsansatz, dargestellt für einige stark hemmende HPLC-Fraktionen (mit ihren
rjetentionszeiten gekennzeichnet). (n = 2). im inkubationsansatz sind 25 ju- darmproteasen
und 75 ^L Wasser/Tannin Gemisch........................................................................................................138
Abb. 45: Relative Aktivitätshemmung der HPLC-Fraktionen. Die relative Aktivitätshemmung
ergibt sich aus der absoluten hemmung in % (abb. 43), multipliziert mit 1000 und dividiert
durch die peakfläche im rohextrakt. voraussetzung für die anwendung dieser formel ist,
dab . sich Hemmung und Peakfläche innerhalb des linearen Anstiegsbereiches der
sättigungskurve (abb.44x die den zusammenhang von tanntnkonzentration und
aktivitätsreduzierung beschreibt, befinden. daher sind für fraktionen mit hoher
aktivitätsreduzierung die berechneten werte nach der bestimmung ihrer sättigungskurve
soweit wie notwendig, korrigiert worden (korrigierte werte).................................................... 139
abb. 46a-d: Reduzierung der Darmproteasenakttvität durch HPLC-Fraktionen. Abgebildet sind
die absolute reduzierung (= akt. reduzierung) und die relative reduzierung pro 1000
Peakflächeneinheiten (= Akt. Reduzierung/1000 mV*min) in Abhängigkett von;.......................144
Abb. 47a, b; Reduzierung der Darmproteasenakttvität durch die Maskierung der Proteasen bei
Proteinüberschub (a) und Proteinmangel (b) im Inkubationsansatz, abgebildet sind die
absolute Reduzierung (= Akt. Reduzierung) und die relative Reduzierung pro 1000
peakflächeneinherren (= akt. reduzierung/1000 mv min) durch die von der jeweiligen hplc-
fraktion an den proteasen gebundenen peakfläche (bv mv*m!n)- für die regressionsgeraden
sind deren geradengleichungen lind bestimmtheitsmabe (r2) angegeben...................................146
Abb. 48: Relative Reduzierung der Darmproteasenaktivität in Abhängigkeit von der Affinität
der HPLC-Fraktionen bei Proteinüberschus und -Mangel im Inkubationsansatz sowie deren
Konkurrenzfaktor. Für die Regressionsgeraden sind deren Geradengleichungen und
bestimmtheitsmaße (r2) angegeben......................................................................................................148
abb. 49: reduzierung der peakflächen durch zugabe von toxin/endotoxin gemisch, das aus
verschiedenen mengen dtpel extrahiert und anschl1ebend in proteasensekret gelöst wurde. 151
Abb. 50: Prozentuale Reduzierung der Peakflächen der HPLC-Fraktionen (Affinintäten) durch
ein toxin. endotoxin gemisch bei proteinüberschua (3g dlpel).......................................................152
abb. 51: Reduzierung der Peakflächen durch ein Toxin/Endotoxin Gemisch bei Proteinmangel
und Konkurrenzfaktoren der HPLC-Frakttonen.............................................................................155
Abb. 52 a bis d: Affinität (= Peakflächenreduzierung in Prozent) der HPLC-Fraktionfn bei
proteinmangel und -überschub gegenüber einem endotoxin/toxin gemisch und
konkursenzfaktor (100%= 1,0) der hplc-fraktionen gegenüber b. thuringiensis toxinen in
abhängigkeit von:...................................................................................................................................159
V
Abbi ldungsverzeichnis
Abb. 53: Affinität der Tannine zu Endotoxin von B.
THVRINGIENSIS DARGESTELLT IN REDUZIERUNG DER
Peakfläche (X=280nm) in Prozent.................................................................................... 161
Abb. 54: Veränderung der reduzierten Peakfläche durch den enzymatischen Abbau des
Endotoxins in Prozent der Peakfläche der HPLC-Fraktion im Überstand der O-Probe Die 0-
probe enthieltproteasensekret ohneä thl/xmgiensistoxine.......................... jgj
ABB. 55: MORTALITÄT DER LARVEN DJ ABHÄNGIGKEIT VON DER ZETT NACH INFEKTION UND VON
VERSCHIEDENEN HPLC-FRAKTIONEN (P), DIE MTT DEM 7,5 IU TNKUBIERT WAREN DIE UL (= MCL)
Angaben beziehen sich auf das Volumen des Tanninrohextraktes, aus dem die Fraktionen
GEWONNEN WURDEN. DIE ZAHLEN NACH P GEBEN DIE ELUTIONSZErr DER FRAKTIONEN IN MINUTEN AN
ALS VERGLEICHSGRÖ8EN SIND 0 IU UND 7,5 IU MIT 50% TANNINROHEXTRAKT WÄHREND DER
Inkubation mit dargestellt.............................................................................. 17
Abb. 56: Zunahme des Larvengewichtes (in Gramm) nach Infektion mit 7,5 iu bei verschiedenen
HPLC-Fraktionen (P) während der Inkubation. Die hl (= mcl) Angaben beziehen sich auf das
Volumen des Tanninrohextraktes aus dem die HPLC-Fraktionen gewonnen wurden Die
Ziffern nach P geben die Elutionszeit des Peaks in Minuten an. als Verolhchsgrösen sind o
IU und 7,5 IU mit 50% Tanninrohextrakt während der Inkubation mit dargestellt i 74
Abb. 57: Verlauf der k-Werte nach Infektion Mrr 7,5 IU bei verschiedenen HPLC-Fraktionen (P)
WÄHREND DER INKUBATION. DIE HL (= MCL) ANGABEN BEZIEHEN SICH AUF DAS VOLUMEN DES
Tanninrohextraktes, aus dem HPLC-Fraktionen gewonnen wurden. Die Ziffern nach P geben
die Elutionszeit des Peaks in Minuten an. Als Verglhchsorö6en sind 0 IU und 50%
Tanninrohextrakt während der Inkubation mit dargestellt.......................................................185
Abb. 58: Mortalität in Abhängigkeit von der Zeit nach Infektion mit 7,5 IU bei verschiedenen
Konzentrationen von Peak 66 Minuten während der Lnkubation. Die xl (= mcl) angaben
beziehen sich auf das volumen des tanninrohextraktes aus dem die hplc- fraktionen für
den Inkubationsansatz gewonnen wurden. Als VERGLEICHSGRÖßE ist neben den verschiedenen
Konzentrationen von Peak 66 Minuten Peak 240 Minuten mit dargestellt................................189
Abb. 59: Entwicklung der Larvengewichte nach Infektion mit 7,5 IU Be verschiedenen
Konzentrationen von Peak 66 Minuten während der Inkubation. Die hl (= mcl) Angaben
. beziehen sich auf das volumen des tanninrohextraktes aus dem die hplc-fraktionen für
den Inkubationsansatz gewonnen wurden, als vergleichsgrö8e ist die Entwicklung der
Larven im Ansatz mit Fraktion 240 Minuten dargestellt...............................................................191
Abb. 60: Verlauf der k-werte nach Lnfektion Mrr 7,5 IU bei verschiedenen Konzentrationen von
Peak 66 Minuten während der Inkubation. Die jü- (= mcl) angaben beziehen sich auf das
Volumen des Tanninrohextraktes, aus dem die HPLC-Fraktionen für den Inkubationsansatz
gewonnen wurden. als vergleichsgrobe ist der verlauf der fraktion 240 dargestellt.......192
abb. 61: mortautät is abhängigkeit von der zeit nach infektion mtt 7,5 iu und 16 iu bei
verschiedenen konzentrationen von peak 240 minuten während der inkubation. die hl (=
mcl) angaben beziehen sich auf das volumen des tanninrohextraktes, al s dem die
Fraktionen für den Inkubationsansatz gewonnen wurden............................................................194
Abb. 62: Entwicklung der Larvengewichte in Abhängigkeit von der Zeit nach Infektion mtt 7,5 IU
und 16 iu bei verschiedenen konzentrationen von peak 240 minuten während der
Inkubation. Die ^l (= mcl) Angaben beziehen sich auf das Volumen Tanninrohextrakt, aus
dem die HPLC-Fraktionen für den Inkubationsansatz gewonnen wurden...................................195
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 63: Verlauf der k-Werte nach Infektion mit 7,5 IU und 16 IU bei verschiedenen
Konzentrationen von Peak 240 Minuten während der Inkubation. Die il (= mcl) Angaben
beziehen sich auf das volumen des tanninrohextraktes, aus dem die hplc-fraktionen für
den Inkubationsansatz gewonnen wurden.........................................................................................198
Abb. 64: Reduzierung der Mortalität durch eine definierte B. thuringiensis Infektion (7,5 od. 16
IU) Bi Abhängigkeit von der Menge der applizierten HPLC-Fraktionen, ausgedrückt in der
EXTRAHIERTEN BLATTFRISCHMASSE. P 66 = HPLC-FRAKTION 66 MINUTEN ELUTIONSZEIT,
ENTSPRECHEND P 240..................................................................................................................................200
Abb. 65: Beeinflussung der mittleren Larvengewichte bei einer definierten B. thvringiensis
Infektion (7,5 od. 16 IU) in Abhängigkeit von der Menge der applizierten HPLC-Fraktionen,
AUSGEDRÜCKT IN DER EXTRAWERTEN BLATTFRISCHMASSE. 0 IU = NICHT INFIZIERT, P 66 = HPLC-
Fraktion 66 Minuten Elutionszeit, entsprechend P 240..................................................................202
Abb. 66: Beeinflussung der mittleren k-Werte bei einer definierten B. thurjngiensis Infektion (7,5
od. 16 IU) in Abhängigkeit von der Menge der applizierten HPLC-Fraktionen, ausgedrückt in
DER EXTRAHIERTEN BLATTFRISCHMASSE. 0 IU = NICHT INFIZIERT, P 66 = HPLC-FRAKTION 66 MINUTEN
ELUTIONSZErr, ENTSPRECHEND P................................................................................................................203
Abb. 67a-d: Reduzierung der Mortalität von L dispar Larven (L3), die mit 7,5 IU B. thuringiensis
infiziert wurden, durch wirksame HPLC-Fraktionen.......................................................................207
Abb. 68: Saisonale Veränderungen der Eichenblatt-Tannine. Signifikante Unterschiede sind mit
unterschiedlichen buchstaben gekennzeichnet (n=8, a=0,05, t-test, einseitig, gepaart)........210
Abb. 69: Bbpielchromatogramme (X=280 nm; n=8) für Blätter Sjähriger Stieleiche - Quercus
robur (tg=0,7g), am 25. mai und am 16. juu sowie für 40 mg tannic acid in 10 ml 5 v.iger
Ameisensäure. Peaks, die ihrer Fläche nach im Mai und Juli signifikant unterschiedlich (t-
test, einseitig, gepaart, n=8, ot » 0,05) waren, sind mit ihrer elutionszerr in min.
GEKENNZEICHNET. BH DEM CHROMATOGRAMM FÜR TaNNIC ACID SIND DIE PEAKS, DIE AUCH IN DEN
Blättern am 25. Mai und am 16. Juli gefunden wurden, mit deren Zuordnungsnummer
gekennzeichnet........................................................................................................................................212
Abb. 70: beipielchromatogramme (kondensierte Tannine; *=640 nm; n=8) für Blätter »jähriger
Stieleiche - Quercvs robvr (TG=0,7g), am 25. Mai (a) und am 16. Juli (b). Peaks, die ihrer
Räche nach im Mai und Juli signifikant unterschiedlich (t-Test, einseitig, gepaart, n=8, a =
0,05) WAREN UND DEREN PEAKFLÄCHE IN KANAL 2 DEUTLICH GRÖßER WAR ALS IN KANAL 1, SIND MIT
IHRER ELUTIONSZErr IN KANAL 1 GEKENNZEICHNET. NACH 150 MINUTEN ELUTIONSZErr SIND KEINE
Peaks zu finden .........................................................................................................................................213
Abb. 71: absolute Hemmung der PROTEASENAKnvrrÄT von l. dispar durch verschiedene Faktoren.
Die R; Werte geben die Bestimmtheitsmabe der Regressionsgeraden an, die den
Zusammenhang von Hemmung und Faktor angeben. Je gröber der R- Wert, desto mehr ist der
jeweilige Faktor am Hemmechanismus ursächlich beteiligt..........................................................222
Abb. 72: Relative Hemmung der Proteasenakttvität von l. dispar durch verschiedene Faktoren.
Die R: Werte geben die BEsriMMTHEtTSMAiJE der Regressionsgeraden an, die den
Zusammenhang von Hemmung und Faktor angeben. Je gröber der R1 Wert, desto mehr ist der
jeweilige Faktor am Hemmechanismus ursächlich beteejgt..........................................................223
VII
Abbildungsverzeichnis
Abb. 73 a, b: Reduzierung der Mortalität durch HPLC-Fraktionen. die L dispar Larven (L3)
WURDEN 7,5 IU B. THURINC1EN-SIS INFIZIERT. ABGEBILDET IST DIE REDUZIERUNO DER MORTALITÄT
DURCH HPLC-FRAKTIONEN AUS 0,5 MG (TG) BLATTMEHL IN ABHÄNGIGKEIT VON DEREN MASKIERUNG
DER DARMPROTEASENPROTHNE BEI PROTEINMANGEL (A) UND -ÜBERSCHUB (B) IM INKUBATIONSANSATZ.
Dm Mebpunkte sind mtt der Elutionszeit der HPLC-Fraktionen in Minuten gekenn-zhchnet.
Für die Regressionsgeraden sind deren Geradengleichungen und Bestimmtheitsmabe (R2)
ANGEGEBEN.................................................................................... ........................................................... 235
Abb. 74 a, b: Reduzierung der Mortalität durch HPLC-Fraktionen. Die L dispar Larven (L3)
wurden mit 7,5 iu b. thuringiens1s infiziert. abgebildet ist die reduzierung der mortalität
durch hplc-fraktionen aus 0,5 mg (tg) blattmehl in abhängigkeit von deren relativen (je
1000 mVmin peakfläche) (a) und absoluten (b) Reduzierung der Darmproteasenaktivität
Die Mespunkte sind mit der Elutionszeit der HPLC-Fraktionen in Minuten gekennzeichnet
für die regressionsgeraden sind deren geradengleichungen und bestmmtheitsmabe (r-)
angegeben......................................................................................................................................... 236
Abb. 75: Reduzierung der Mortalität von L dispar Larven (Lj), die mit 7,5 IU B. thuringiensis
INFIZIERT WURDEN, DURCH HPLC-FRAKTIONEN. ABGEBILDET IST DIE REDUZIERUNG DER MORTALITÄT
durch HPLC-Fraktionen aus 0,5 mg (TG) Blattmehl in Abhängigkeit von der Maskierung
(Reduzierung der Peakfläche in mV*min) der Endotoxinproteine von B. thuringiensis bei
Proteinmangel im Inkubationsansatz. Die Mebpunkte sind mit der EmnoNSZErr der HPLC-
Fraktionen in Minuten gekennzeichnet. Für die regressionsgeraden sind deren
Geradengleichungen und Bestimmtheitsmaije (R~) angegeben.......................................................23g
Abb. 76: Reduzierung der Mortalität von L dispar Larven (L3). die mit 7,5 IU B. thuringiensis
INFIZIERT WURDEN, DURCH HPLC-FRAKTIONEN. ABGEBILDET IST DIE REDUZIERUNG DER MORTALITÄT
durch HPLC-Fraktionen aus 0,5 mg (TG) Blattmehl dm Abhängigkeit von der Maskierung
(Reduzierung der Peakfläche in mV min) der Toxinproteine von B. thuringiensis bei
Proteinmangel m Inkubationsansatz. Die Mebpunkte sind mit der Elutionszeit der HPLC-
Fraktionen in Minuten gekennzeichnet. Für die reoressionsgeraden sind deren
Geradengleichungen und Bestimmthettsmabe (R2) angegeben.......................................................239
abb. 77: : hemmung der mortalität von l. dispar nach lnfektion mit 7,5 [u b. thuringieksis durch
die Bindung der HPLC-Fraktionen an die Proteine Proteasen, Endotoxin und Toxin sowie
einiger photometrisch bestimmter parameter der hplc-fraktionen. in zusammenhang mit
diesen Ursachen für eine Hemmwirkung wurden verschiedene davon abgeleitete qualitative
und quantitative faktoren als hemmursache überprüft. die r2 werte geben die
bestimmtheitsmaße der regressionsüeraden an, die den zusammenhang von hemmung und
Faktor angeben. Je gröber der R; Wert, desto mehr ist der jeweilige Faktor am
HEMMECHANISMUS URSÄCHLICH BETEILIGT................................................................................................24!
I
Tabellenverzeichnis
8 Tabellenverzeichnis
Tab. i: Charakterisierung der Eigelegefraktjonen von L. dispar...............................................................8
Tab. 2: Entwicklungserfolg von L. dispar auf Standarddiät und FePO4 angereicherter Diät;
SIGNIFIKANT UNTERSCHIEDLICHE GEWICHTE SIND MIT UNTERSCHIEDLICHEN BUCHSTABEN
GEKENNZEICHNET (a=0,05, T-TEST)..............................................................................................................64
Tab. 3: Mortalität von L. dispar auf Standarddiät und FePO4 angereicherter Diät. Signifikante
Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet (a=0,05, GLIM f.
bwomial Fehler).........................................................................................................................................65
Tab. 4: Weibchenanteil und Unterschiede in der Larvalentwicklungszeit bis zur Verpuppung
(Entwicklungsdauer bei Standardfutter wird auf 0 Tage gesetzt) bei Aufzucht von L dispar
auf Standarddiät und FePO4 angereicherter Diät. Signifikante Unterschiede sind mit
unterschiedlichen buchstaben gekennzeichnet; (a=0,05, ewfaktorielle anova, kruskal-
Walus Test bei Weibchenanteil und Bonferroni Test bei Entwicklungsdauer)...........................65
Tab. 5: Eilarvenschlupf (Prozent) von l dispar aus den Gelegen der Folgegenerationen bei..........66
Tab. 6: Einflus der Position der Eier du Gelege auf die Mortalität von Larven und Puppen bei L.
dispar; signifikante Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet
(a=0,05, GLiM f. binomial Fehler)...........................................................................................................68
Tab. 7: Puppengewichte von L. dispar in Abhängigkeit vom Ort der Eiablage; signifikant
UNTERSCHIEDLICHE GEWICHTE SIND MIT UNTERSCHIEDLICHEN BUCHSTABEN GEKENNZEICHNET (ct=0,05,
EiNFAKTORiEixE Anova, Bonferroni Test)..............................................................................................69
Tab. 8; Einflub der Position der Eier im Gelege auf den Weibchenanteil und Unterschiede in der
Larvalentwickjlungsdauer bis zur Verpuppung (Oberes Drittel wird als 0 Tage gesetzt) je
nach Ort der Eiablage; signifikante Unterschiede sind mit unterschiedlichen Buchstaben
gekennzeichnet (o =0,05, einfaxtorelle anova, kruskal-wallis test bei
Geschlechterverhältnis und Bonferroni Test bei Entwicklungsdauer)......................................69
Tab. 9: Puppengewichte der Mutter- und Tochtergenerationen von L. dispar mit Standarddiät
GEFÜTTERT. SlöNDTKANTE UNTERSCHIEDE SIND MTT UNTERSCHIEDLICHEN BUCHSTABEN
GEKENNZEICHNET ( X=0,05; ANOVA)...........................................................................................................70
Tab. 10: Durchschnittliche Dauer bis zum Tod der Larven von L. dispar in Abhängigkeit von der
Dauer der Aktivierung des B. muRifiGiENSts mit Darmproteasen. Signifikante Unterschiede
SIND DURCH UNTERSCHIEDLICHE BUCHSTABEN GEKENNZEICHNET (T-TEST; OL=0,05)..................................75
Tab. 11: MrrTLERE Larvengewichte (in g) der Larvenkollekttve, an die 2 [U B. muRi.vaE.vsis, das
verschieden lang mit proteasen von l dispar inkubiert war, verfüttert wurde. in den
Spalten der unken Tabellenhäute stehen die Gewichte in Abhängigkeit von den Stunden
nach infektion der larven (1. spalte). auf der rechten hälfte sind in den spalten die
Prozessierungszetten angegeben, die im vergleich zu der in der 2. Zeile angegebenen
Prozessierungszeit zu signifikant niedrigeren Larvengewichten geführt haben (t-Test; a =
0.05). Sto. = Stunden nach Infektion......................................................................................................76
n
Tabellenverzeichnis
Tab. 12: Mittlere k-Werte der Larvenkollektive, an die 2 IU B. thuringiensjs, das verschieden
LANG MIT PROTEASEN VON L DISPAR INKUBIERT WAR, VERFÜTTERT WURDE. IN DEN SPALTEN DER LINKEN
Tabellenhälfte stehen, die k-Werte in ABHÄNOiOKErr von den Stunden nach Infektion der
Larven (2. Zeile). Auf der Rechten Hälfte sind in den Spalten die PROZEssosRUNoszErrEN
ANGEGEBEN, DIE IM VERGLEICH ZU DER DJ DER 2. ZEILE ANGEGEBENEN PROZESSIERUNGSZEIT ZU
SIGNIFIKANT NIEDRIGEREN K-WERTEN GEFÜHRT HABEN (T-TEST; X =¦ 0,05). STD. = STUNDEN NACH
Infektion.................................................................................................................................................. g0
Tab. 13: Vergleich von Variante 1 und Variante 2 bei verschiedenen einrotierten Fraktionen
einer säulenchromatographischen trennung mit sephadex lh-20 und einem
diskontinuierlichen acetongradienten, mit verschiedenen kolorimetrischen tests. das
angegebene Gewicht bezieht sich auf Trockenmasse Blattmehl....................................... 82
Tab. 14: Verhältnisse von Variante 1 zu Variante 2 bei verschiedenen einrotierten Fraktionen
einer säulenchromatographischen trennung mit sephadex lh-20 und einem
diskontinuierlichen acetongradienten, mit verschiedenen kolorimetrischen tests................83
Tab. 15: pH-Werte der einrotierten Aceton-Fraktionen der 1. und 2. Aufarbeitung der
Tanninrohextrakte der Eichenblätter................................................................................................83
Tab. 16iMittel werte aus den Mesergebnissen für die aus dem Eluat während der Elution
entnommenen aliquote. angegeben sind die gehalte an glucose, gebundener und freier
Gallussäure (Rhodanin-Test) sowie deren Verhältnisse zueinander............................................88
Tab. 17: Mittel werte aus den Meisergebnissen für die aus dem Eluat während der Elution
entnommenen aliquote. angegeben sind die gehalte an founpositiven verbindungen,
kondensierten tanninen (porter-test) und gesamtgallussäure (rhodanin-test), sowie
deren Verhältnisse zueinander..............................................................................................................89
Tab. 18: Darmproteasenaktivitäten von L. dispar, nachdem die Larven ca. 2 Wochen Futter, das
MtT Aceton-Fraktionen versetzt war gefressen hatten. Signifikant unterschied-uche
aktivitäten sind mrt einem • gekennzeichnet (t-test,a= 0,05, n=15) ...........................................113
Tab. 19: Korrelationskoeffizienten zwischen den Eigenschaften (= Gehalt an) und wirklingen (=
Reduzierung der) der Aceton-Fraktionen.........................................................................................116
Tab. 20: Rangfolge der 15 HPLC-Fraktionen mit der höchsten affimtät zu Proteasen von L dispar
bei Proteinüberschud (5,64 mg/Inkubationsansatz von 0,8 ml).......................................................127
Tab. 21: Rangfolge der 15 HPLC-Fraktionen mit der höchsten Affinität zu Proteasen von L
dispar bei Proteinmangel. Diejenigen Substanzen, deren EmnoNSZErr Mrr einem •
gekennzeichnet sind. waren bereits bei proteinüberschub unter den 15 verbindungen mit der
höchsten affinität (tab. 20)..................................................................................................................129
Tab. 22: Rangfolge der HPLC-Fraktionen mit einem Konkurrenzfaktor gröber 1. Der
Konkurrenzfaktor ist das Verhältnis aus dem Anteil der reduzierten Peakfläche an der
gesamten durch proteasenproteine gebundenen peakfläche im konkurrenzfall und im fall
des Proteinüberschusses........................................................................................................................13°
Tab. 23: Rangfolge der 15 HPLC-Fraktionen. die die gröste Prcteasenaktwitätsredczierung
verursachten. der vergleich mit den affinitätsfaktoren zeigt die fraktionen ( ), die auch
in einer komcurrenzsrruation bei proteinmangel (m. k.) - tab. 21 - und bei proteinüberschu8.
also ohne konkurrenz (o. k.) - tab. 20 - zu den 15 substanzen mit der höchsten affinität
(prozentualen peakflächenreduzierung) gehört haben. weiterhin sind die peaks, die einen
Konkurrenzfaktor (Faktor) - Tab. 22 - gröber 1 hatten, mit einem • gekennzeichnet.............136
III
Tabellenverzeichnis
Tab. 24: HPLC-Fraktionen mit einer relativen Aktivitätshemmung über 100%...................................140
tab. 25: rangfolge der 15 hplc-fraktionen mit der größten affinität zu einem toxin/endotoxin
Gemisch, gelöst und hergestellt durch Inkubation (3h/0,5g Dipel) in Proteasensekret von i.
dkpak. Im Inkubationsansatz herrschte Proteinüberschub (Toxine aus 3g Dipel). Die
Peaxflächen wurden mtt Kanal i (A.=28Onm) bestimmt. Die Bezugsgröbe der
Peakflächenreduzierung war ein Inkubationsansatz nur mit Proteasensekret ohne B.
thur1nc1ens1s..............................................................................................................................................153
Tab. 26: Rangfolge der 15 HPLC-Fraktionen mit der gröbten Affinität zu einem Toxin/Endotoxin
Gemisch bei Proteinmangel (0,5g Dipel) in Proteasensekret von L. dispar. Die peakflächen
WURDEN MIT KANAL 1 (X=280NM) BESTIMMT. DIE BEZUGSGRÖBE DER PEAKFLÄCHENREDUZIERUNG WAR
ein Inkubationsansatz mit nur Proteasen und Rohextrakt, ohne B. thukinciehsis. In der
Spalte Überschub sind die Substanzen, die auch zu den 15 Tanninen mit der gröbten Affinität
zum Toxin/Endotoxin Gemisch bei Proteinüberschub (Tab. 25) gehören, mit einem •
gekennzeichnet........................................................................................................................................154
Tab. 27: HPLC-Fraktionen mit Konkurrenzfaktoren s 1. Sie ergeben sich durch Division der
anteile der reduzierten peakfläche eines peaks an der gesamten reduzierten peakfläche bei
Proteinmangel und bei Proteinüberschub. Das Toxin/Endotoxin Gemisch wurde gelost und
hergestellt durch lnkubation in proteasen von l. dispar. die peakflächen würben mit
kanal 1 (a.=28onm) bestimmt. de bezugsgröse der peakflächenreduzierung war ein
inkubationsansatz nur mtt proteasen und rohextrakt, ohne b. thvring1ensis. in den spalten
überschuß bzw. konkurrenz sind die substanzen, die auch zu den 15 tanninen mit der
gröbten affinttät zum toxin/endotoxin gemisch bei prote1nüberschu8 (tab. 25) bzw. bei
Proteinmangel (Tab. 26)gehören, mit einem * gekennzeichnet.......................................................156
Tab. 28: Die 15 HPLC-Fraktionen mit der gröbten Affinität zu Endotoxin von B. thurisgieihsis,
ausgedrückt is der reduzierung ihrer peakfläche in prozent. in den spalten überschub,
Mangel bzw. Konkurrenzfaktor sind die Substanzen, die auch zu den 15 Tanninen mit der
gröbten afftnttät/konkurrenzfaktor (tab. 27) zum toxin/endotoxin gemisch bei
proteinüberschub (tab. 25) bzw. -mangel (tab. 26) gehören, mit einem * gekennzeichnet.......162
Tab. 29: Überblick ausgewählte HPLC-Fraktionen: Wellenlänge der Extinktionsmaximas in nm
und deren höhe sowie einige chemisch analytische parameter (photometrische tests). die
für den bloassay bestimmten verbindungen sind fett gedruckt...................................................167
Tab. 30: HPLC-Fraktionen aus 100 hl Tanninrohextrakt und deren Einflub auf die Mortalität
von 7,5 rj b. thumngiessis. die hplc-fraktionen sind mit ihrer elltionszeit in minuten
angegeben. sie sind entsprechend ihres die mortalrrät hemmenden einflusses in gruppen
eingeteilt (0=kein elnflufl; 5 stark hemmender einflxrt). neben den t anninen und der 0-probe
(7,5 tu oh. Tannin) sind noch die Einflüsse des Rohextraktes (RE-50% in 7.5IU), 0IU und 16IU
b. nurjnqieüsls angegeben. n = anzahl der versuchslarven; std. bis tod = mittlere zeit bis
zum Tod der Larven in Stunden............................................................................................................169
Tab. 31: Signifikante Unterschiede im Einflub der HPLC-Fraktionen aus 100 hl Tanninrohextrakt
auf die Mortalität von 7,5 IU B. thvrihgiensis. Die HPLC-Fraktionen sind mit ihrer
ELUTIONSZErr IN MINUTEN (PEAK) ANGEGEBEN. SIE SIND ENTSPRECHEND IHRES DIE MORTALITÄT
HEMMENDEN EINFLUSSES IN GRUPPEN (SPALTE G) EINGETEILT (0=KEIN EINFLUß; 5 STARK HEMMENDER
Einflub). Neben den Tannmen und der 0-Probe (7,5 IU oh. Tannin) sind noch die Einflüsse des
Rohextraktes (RE-50% in 7 JIU), 0 IU und 16 IU B. thvringiensis angegeben. N = Anzahl der
Versuchslarven; Std. bb Tod - mittlere Zett bis zum Tod der Larven in Stunden.
Signifikante Unterschiede sind mit einem* gekennzeichnet (opO,05, GUM)................................170
IV
Tabellenverzeichnis
Tab. 32: In den Tabellen sind in den Zeilen die Elltionszeiten derjenigen HPLC-Fraktionen und dze
zum Vergleich dienenden Behandlungsvarianten angegeben, die zusammen mit 7,5 IU B.
THURINGIENS1S ZU SIGNIFIKANT KLEINEREN (T-TEST; a=0,05) I_ARVENGEWICHTEN GEFÜHRT HABEN, WIE
die in der Spalte P (=Peak) angegebene HPLC-Fraktion oder die Behandlung. In der Spalte
GEW SIND DIE MITTLEREN LARVENGEWICHTE DER VERSUCHSTIERE. DIE MIT 7.5 IU B. THURINGIESSIS
INFIZIERT WURDEN. DAS ZUVOR MIT VERSCHIEDENEN HPLC-FRAKTIONEN AUS 100 jjL
Tanninrohextrakt inkubiert war. Behandlungsvarianten sind: 7,5 IU = B. thvringiensis
ohne Tanninzugabe. 0 IU = H:O bidest. ohne Tannin und B. thurinoiensis, RE = 50%
Tanninrohextrakt und 7,5 IU B. thuringiensis. Std. sind die MEßZEnruNKTE in Stunden nach
Infektion...................................................................................................................................................177
Tab. 33: In den Tabellen sind in den Zeilen die Elutconszeiten derjenigen HPLC-Fraktionen und die
zum Vergleich dienenden Behandlunosvarianten angegeben, die zusammen mit 7,5 IU B.
THURINGIENSIS ZU SIGNIFIKANT KLEINEREN (T-TEST; a=0,05) K-WERTEN GEFÜHRT HABEN, WIE DIE IN-
DER Spalte P (=Peak) angegebene HPLC-Fraktion oder die Behandlung. In der Spalte k-Wert
SIND DIE MITTLEREN K-WERTE DER VERSUCHSTIERE, DIE MIT 7,5 IU B. THVKJNGlESSß INFIZIERT WURDEN,
DAS ZUVOR MIT VERSCHIEDENEN HPLC-FRAKTIONEN AUS 100 HL TANNINROHEXTRAKT INKUBIERT WAR.
BEHANDLUNGSVARIANTEN SIND: 7,5 IU = D-PROBE OHNE TANNINZUGABE, 0 IU = H2O BIDEST. OHNE
Tannin und B. thurisgiensis, RE = 50% Tanninrohextrakt und 7,5 IU B. thurinciensis. Std.
sind die meozeitpunkte in stunden nach infektion............................................................................j g2
Tab. 34: Zunahme der mittleren Larvengewichte in Gramm in Abhängigkeit von der Blatt-
mehlmassc (fg=frischgewicht), aus der die hplc-fraktion 66 minuten gewonnen und mit 7,5
iu b. thvrinciessis an die larven von l. dispar verfüttert wurde. auf der rechten seite sind
ln den zeilen die konzentrationen aufgeführt, die im vergleich zu denjenigen im
Spalte.nkopf zu signifikant niedrigeren Larvengewichten geführt haben (t-Test; a=0,05).
Std. = Stunden nach Infektion mit B. thlrisgiensis..........................................................................190
Tab. 35: Verlauf der mittleren k-Werte nach Infektion in Abhängigkeit von der Blattmehl-
masse (FG=Frischgewicht) aus der die HPLC-Fraktion 66 Minuten gewonnen und mit 7,5 IU B.
thlr1ngiessis an die larven von l. dispar verfüttert wurde. alt der rechten seite sind in den
Zeilen die Konzentrationen aufgeführt, die im Vergleich zu denjenigen im Spaltenkopf zu
signifikant niedrigeren k-werten geführt haben (t-test; a=0,05). std. = stunden nach
Infektion mit B. thviusgiensis................................................................................................................193
Tab. 36: Zunahme der mittleren Larvengewichte in Gramm in Abhängigkeit von der
Blattmehlmasse (FG=Frischgewicht), aus der die HPLC-Fraktion 240 Minuten gewonnen und
mit 7,5 iu b. thvringiessis an die larven von l dispar verfüttert wurde. alt der rechten
Seite sind in den Zeilen die Konzentrationen aufgeführt, die im Vergleich zu denjenigen im
Spaltenkopf zu signifikant niedrigeren Larvengewichten geführt haben (t-Test; a=0,05).
Std. = Stunden nach Infektion mit B. thvrisgiensis..........................................................................196
TAB. 37: ZUNAHME DER MITTLEREN LARVENGEWICHTE IN GRAMM IN ABHÄNGIGKEIT VON DER BLATT-
MEHLMASSE (FG=Frischgewicht). aus der die HPLC-Fraktion 240 Minuten gewonnen und Mrr 16
iu b. thurisgiessis an die larven von l dispar verfüttert wurde. auf der rechten seite sind
in den Zeilen die Konzentrationen aufgeführt, die im Vergleich zu denjenigen im
Spaltenkopf zu signifikant niedrigeren Larvengewichten geführt haben (t-Test; a=0,05).
Std. = Stunden nach Infektion Mrr B. mumviEKSis..........................................................................197
Tab. 38: Verlauf der mtttleren k-Werte nach Lnfektion in Abhängigkeit von der Blattmehlmasse
(FG-Frbchgewicht). aus der die HPLC-Fraktion 240 Minuten gewonnen und mit 7,5 IU B.
thirihgiessis an die larven von l. dispm verfüttert wurde. auf der rechten sette sind in den
Zeilen die Konzentrationen aufgeführt, die im Vergleich zv denjenigen im Spaltenkopf zu
signifikant niedrigeren k-werten geführt haben (t-test: a=0.05). std. = stunden nach
Infektion mit B. thuringiessis................................................................................................................199
V
Tabellenverzeichnis
Tab. 39: Verlauf der mittleren k-Werte nach Infektion in Abhängigkeit von der Blattmehlmasse
(FG=Frischgewicht), aus der die HPLC-Fraktion 240 Minuten gewonnen und mit 16 IU B.
thvr1ng1ens1s an die larven von l. d1spar verfüttert wurde. auf der rechten serte sind in den
Zeilen die Konzentrationen aufgeführt, die im Vergleich zu denjenigen im Spaltenkopf zu
signifikant niedrigeren k-werten geführt haben (t-test; a=0,05). std. = stunden nach
Infektion mit B. twjmngiensis.................................................................................................................199
TAB. 40: MITTLERE DAUER BIS ZUM TOD IN STUNDEN, BEI EINER INFEKTION MIT 75 IU (N=20), DIE DURCH DIE
HPLC-Fraktionen 58, 66, 144 und 240 Minuten gehemmt wurde. Die Inkubation von 75 IU B.
thumngiexsb erfolgte mit dem extrakt von 0,125 mg blattmehl dieser fraktionen. dm
Verbindungen sind durch ihre Elutionszeit in Minuten charakterisiert. Signifikante
Unterschiede sind mit einem • gekennzeichnet (t-Test; a=0,05). Std. = durchschnittlicher
ZEtTRAUM BIS ZUM TOD...............................................................................................................................204
Tab. 41: Mittlere Peakflächen pro mg Blattmehl (TG) derjenigen HPLC-Fraktionen, die du Mai
und Juli signifikant unterschiedliche Peakflächen besagen (t-test, einseitig, gepaart, n=8, a
0,05). Das Signifikanzniveau (=Sig.) ist angegeben. Die Fraktionen, die von Mai bis Juli
signifikant zunahmen (differenz ist negativ), sind kursiv. gleichzeitig sind das auch die
Fraktionen, die nach Treutter kondensierte Tannine sind (s.a. Abb. 70). (Elu. Zeit =
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