Molekulare Identifizierung herbizider Zielenzyme in Tabak (Nicotiana tabacum L.) mit Hilfe des T-DNA Aktivierungsansatzes:
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| adam_text | Titel: Molekulare Identifizierung herbizider Zielenzyme in Tabak (Nicotiana tabacum L.) mit Hilfe des T-DNA
Autor: Freitag, Jens
Jahr: 1999
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Herbizide und Herbizidresistenzentwicklung 1
1.2 Glyphosat, eine Inhibitor der 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphate Synthase 4
1.2.1 Mutierte 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphate Synthase 5
1.2.2 Glyphosat degradierende Enzyme 6
1.2.3 Überproduktion der Wildtyp 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphate Synthase 6
1.3 Identifizierung von Genen mittels Insertionsmutagenese 8
2 Zielsetzung 12
3 Material und Methoden 13
3.1 Material 13
3.1.1 Chemikalien und Enzyme 13
3.1.2 Geräte 14
3.1.3 Oligonukleotide 14
3.1.4 Bakterienstämme und Vektoren 15
3.1.5 Pflanzenmaterial 16
3.1.6 Medien 16
3.2 Methoden 17
3.2.1 Tabakprotoplastenisolation 17
3.2.2 Transformation von Tabakzellen durch Kokultivation 18
3.2.3 Gewebekultur 19
3.2.4 Pflanzenanzucht und generative Vermehrung 21
3.2.5 Selektionsexperimente 21
3.2.6 Gesamt DNA / RNA Präperation aus pflanzlichem Gewebe 22
3.2.7 DNA-Blot Analyse 23
3.2.8 RNA-Blot Analyse 24
3.2.9 PCR-Amplifizierung 25
3.2.10 PlasmidRescue 25
3.2.11 DNA-Klonierung und-Sequenzierung 26
4 Ergebnisse 27
4.1 Experimentelle Strategie und Beschreibung des Vektors 27
4.2 Systemetablierung 29
4.2.1 Einfluß der Tabakvarietäten SNN und SRI auf die Protoplastierung 29
4.2.2 Einfluß der Tabakvarietät auf die Transformationsrate 31
4.2.3 Einfluß der Kokultivierung 33
4.2.4 Einfluß der Geräte auf die Transformationsrate 34
4.2.5 Einfluß der Zellulase 35
4.2.6 Resümee zur Systemetablierung 36
4.3 Etablierung der Selektionsbedingungen ( Kill Curve Experimente) 36
4.3.1 Wirkung unterschiedlicher aktiver Substanzen (AS) 37
4.3.2 Wirkung unterschiedlicher Lösungsmittel 41
4.4 Activation Tagging Experimente 42
4.5 Molekulare Analysen der T-DNA Integration 45
4.5.1 PCR Nachweis der T-DNA Integration 45
4.5.2 DNA-Blot Nachweis einer T-DNA Integration 47
4.6 Gewächshausselektionsexperimente 49
4.6.1 Ermittlung der Dosis-Wirkungs-Beziehung für Pflanzen 49
4.6.2 Spritzexperimente mit Ti-Generation 51
4.7 Molekulare Analyse mittels eines Tabak EPSPS Fragment 53
4.7.1 RNA-Blot Hybridisierung mit einem EPSPS Fragment 54
4.8 Plasmid Rescue und nachfolgende Analysen 56
4.8.1 Plasmid Rescue aus genomischer Kallus DNA 56
4.8.2 Detailierte Restriktions- und DNA-Blot Analyse des KlonsPRRuR3a 59
4.8.3 Sequenzanalyse des Klons PR RuR3a 60
4.9 Reprotoplastierungsexperimente 61
S Diskassioa 62
5.1 Resistenzinduktion durch cö-aktive Elemente und Analogien 62
5.2 Das Proloplastensystem, Möglichkeiten und Beschränkungen 63
5.3 Das Nicotiana tabacum Genom 64
5.4 Selektion von Tabakzellen und Tabakpflanzen 65
5.5 Analogien und Divergenzen zwischen den selektierten Linien 67
5.5.1 Glyphosatresistenz als Modellsystem 67
5.5.2 Glyphosatresistente Kalluslinien 68
5.5.3 Glyphosattolerante Pflanzen 69
5.6 Plasmid Rescue , Möglichkeiten und Beschränkungen 71
5.7 Die klonierte Sequenz 72
6 Zusammenfassung 74
7 Literatur 76
8 Anhang 88
HI
Abbildungsverzeichnis
Mechanismen zur Herausbildung von Herbizidresistenzen
Herbizidresistenz durch Oberexpression des Zielgens
Insertionsorte bei der Agrobakterien T-DNA Insertionsmutagenese
Zielgenidentifizierung mittels T-DNA Genaktivierung
Activation Tagging Vektor pPCVIC En4 HPT
Abb.l:
Abb.2:
Abb.3:
Abb.4:
Abb.5:
Abb.6:
Abb.7:
Abb.8:
Abb.9:
Abb. 10:
Abb. 11:
Abb.12:
Abb.13:
Abb. 14:
Abb.l 5:
Abb.16:
Abb. 17:
Abb.18:
Abb. 19:
Abb.20:
Abb.21:
Abb.22:
Abb.23:
Abb.24:
Abb.25:
Abb.26:
Abb.27:
Abb.28:
Abb.29:
Abb.30:
Abb.31:
Abb.32:
3
7
9
10
28
Nicotiana tabaccum Protoplasten in verschiedenen Entwicklungsstadien 30
Inhibierung der Protoplastenentwicklung durch Hygromycin 31
Bestimmung der Transformationsrate 32
Bestimmung der Transformationsrate 33
Einfluß von Geräten auf die Kultur von Protoplasten 3 5
Kill Curve Asulam 39
Kill Curve Glyphosat 39
Kill Curve Benfuresat 39
Kill Curve Glufosinat 40
Kill Curve Isoxaben 40
Kill Curve Dichlobenil gelöst in Wasser 40
Kill Curve Dichlobenil gelöst in Aceton 40
Unbedenklichkeitsstudie für Aceton 40
Unbedenklichkeitsstudie für Ethylacetat 40
Gewebekultur nach Activation Tagging 43
PCR Nachweis einer T-DNA Integration 46
Genomischer DNA-Blot verschiedener Kalluslinien 48
Genomischer DNA-Blot pflanzlicher DNA 48
Genomischer DNA-Blot pflanzlicher DNA 48
Kill Curves für Gewächshausselektionsexperimente 50
Gewächshausselektionsexperimente mit Roundup 52
Gewächshausselektionsexperimente mit Roundup 53
RNA Expressionsanalysen transgener Linien 54
RNA Expresstonsanalysen von Wildtyp Pflanzen 56
DNA-Blot Hybridisienmg der Plamid Rescue Klone 58
DNA-Blot Hybridisierung der Ptamid Rescue Klone 58
Restriktionskartierung und DNA-Blot des KkmsPRRuR3 60
IV
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| title_short | Molekulare Identifizierung herbizider Zielenzyme in Tabak (Nicotiana tabacum L.) mit Hilfe des T-DNA Aktivierungsansatzes |
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| topic | Herbizid - Resistenzgen - Isolierung Tabak - Induzierte Resistenz - Glyphosat - t-DNS - Insertionsmutagenese Induzierte Resistenz (DE-588)4354293-1 gnd Isolierung (DE-588)4027787-2 gnd Herbizid (DE-588)4113887-9 gnd Tabak (DE-588)4136670-0 gnd Resistenzgen (DE-588)4280023-7 gnd t-DNS (DE-588)4329557-5 gnd Insertionsmutagenese (DE-588)4212813-4 gnd Glyphosat (DE-588)4157755-3 gnd |
| topic_facet | Herbizid - Resistenzgen - Isolierung Tabak - Induzierte Resistenz - Glyphosat - t-DNS - Insertionsmutagenese Induzierte Resistenz Isolierung Herbizid Tabak Resistenzgen t-DNS Insertionsmutagenese Glyphosat Hochschulschrift |
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