Charakterisierung von Speicherproteinen und Speicherprotein-Genen des Dinkels (Triticum spelta L.) sowie Abgrenzung zum hexaploiden Weizen (Triticum aestivum L.):
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| adam_text | Titel: Charakterisierung von Speicherproteinen und Speicherprotein-Genen des Dinkels (Triticum spelta L.) s
Autor: Radic-Miehle, Helga
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I-Vl
Abkürzungsverzeichnis VII-X
1. Einleitung und Literaturübersicht
1.1. Einleitung 1
1.2. Literaturübersicht 3
1.2.1. Verwandtschaft von Dinkel und Weizen 3
1.2.2. Evolution hexaploider Weizenformen 3
1.2.3. Landwirtschaftliche Bedeutung und
Anbauwürdigkeit des Dinkels 5
1.2.4. Agronomische und morphologische
Besonderheiten des Dinkels 6
1.2.5. Zuchtziele 9
1.2.6. Molekularbiologische Abgrenzung von
T. spelta und T. aestivum 11
1.2.7. Ribosomale Gene 12
1.2.8. Speicherproteine 13
1.2.8.1. Speicherproteine und
ihre Bedeutung 13
1.2.8.2. Backqualität 15
1.2.8.3. Analysen von Speicherproteinen 16
1.2.9. Speicherprotein-Gene 17
1.2.9.1. Expression von
Speicherprotein-Genen 19
1.2.9.2. x-Typ und y-Typ der HMW-
Speicherprotein-Gene 20
1.2.10. Polymerase Chain Reaction (PCR) 21
1.2.11. /n stfu-Hybridisierungen 23
1.2.12. RFLP-Analysen 25
1.2.13. Analysen von Microsatelliten 27
Inhaltsverzeichnis
2. Material
2.1. Pflanzenmaterial 29
2.1.1. Pflanzenmaterial für Hybridisierungsversuche
und PCR 29
2.1.2. Pflanzenmaterial für die Erstellung einer Genkarte
des Dinkels 31
2.2. Untersuchte Pflanzenorgane und -gewebe 31
2.3. Sonden und Primer 31
2.3.1. DNA-Sonden auswärtiger Arbeitsgruppen 32
2.3.2. Speicherprotein-Gen-Sonden aus
Eigenproduktion mittels PCR 34
2.3.3. Primer zur Sondenherstellung 36
2.4. Microsatelliten-Primer 38
2.5. Geräte und Chemikalien 41
3. Methoden
3.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) 42
3.1.1. Probenaufbereitung 42
3.1.2. PAA-Gel-Elektrophorese 43
3.1.3. Färbung, Entfärbung und Konservierung 44
3.1.4. Densitometrische Auswertung 44
3.2. Zuordnung von Glutenin-Subunits 44
3.2.1. Zuordnung von HMW-Glu-Subunits
nach Payne (1981) 45
3.2.2. Zuordnung von Chinese Spring -Banden
nach Galili Feldman (1983) 46
3.3. Kartierung von Speicherprotein-Genen 48
3.4. DNA-Sonden: Herstellung und Markierung 48
3.4.1. Herstellung von Speicherprotein-Gen-
Sonden per PCR 50
3.4.2. Sondenmarkierung 52
3.4.3. Testen der Sondenqualität 56
Inhaltsverzeichnis III
3.5. Fluoreszente in s/fu-Hybridisierung (FISH) 57
3.5.1. Anzucht von Keimwurzeln, Anreicherung
von Metaphasen 57
3.5.2. Entnahme von Wurzelspitzenmeristemen
und Enzymbehandlung 58
3.5.3. Präparation mitotischer Chromosomen 59
3.5.4. Vorbehandlung der Präparate für die DNA:DNA-
in srtu-Hybridisierung 60
3.5.5. Herstellung des Hybridisierungsgemisches 63
3.5.6. DNA:DNA-/n s/fu-Hybridisierung 64
3.5.7. Waschschritte nach der DNA:DNA-Hybridisierung 64
3.5.8. Detektion und Nachweis der markierten
Sonden-DNA mit fluorochrom-
konjugierten Antikörpern 64
3.5.9. Photographische Dokumentation 66
3.6. RFLP-Analysen 67
3.6.1. DNA-Isolation und Restriktionsverdau
(Version I) 67
3.6.2. DNA-Isolation und Restriktionsverdau
(Version II) 69
3.6.3. Herstellung des Agarose-Gels und
Vorbereitung der Elektrophorese 70
3.6.4. Probenaufbereitung und
Start der Elektrophorese 71
3.6.5. Beendigung der Elektrophorese und
Photographieren des Gels 71
3.6.6. Depurinierung 72
3.6.7. Denaturierung in alkalischem Milieu 72
3.6.8. Neutralisierung 72
3.6.9. Southern Blotting 73
3.6.10. Abbau des Southern Blot und
Weiterbehandlung der Nylonmembran 73
3.6.11. Prähybridisierung der Membran 74
IV Inhaltsverzeichnis
3.6.12. Hybridisierung 74
3.6.13. Stringenzwaschschritte 75
3.6.14. Blocking und Antikörper-Reaktion 75
3.6.15. Detektion und Färbung 76
3.6.16. Abstoppen der Färbereaktion 76
3.6.17. Photographische Dokumentation und Auswertung 77
3.7. Analyse von Microsatelliten 77
4. Ergebnisse
4.1. Ergebnisse der SDS-PAGE von Speicherproteinen 80
4.1.1. Zuordnung von HMW-Glu-Subunits
nach Payne et al. (1981) 80
4.1.2. Zuordnung von Chinese Spring -Banden
nach Galili Feldman (1983) 81
4.1.3. Kartierung von Speicherprotein-Genen 84
4.2. Ergebnisse der PCR 87
4.2.1. Herstellung von Speicherprotein-Gen-Sonden 87
4.2.2. DIG-Markierung per PCR 89
4.2.3. PCR als Nachweis spezifischer Sequenzen 89
4.2.4. Isolation und Reamplifikation
spezifischer Amplicons 92
4.3. Ergebnisse der in srfu-Hybridisierungen 93
4.3.1. In s/ru-Hybridisierungen mit ribosomalen Sonden 93
4.3.2. In s/fu-Hybridisierungen mit
Speicherprotein-Gen-Sonden 96
4.4. Ergebnisse der RFLP-Analysen 97
4.4.1. RFLP-Analysen mit ribosomalen Sonden 97
4.4.1.1. RFLP-Analysen mit Sonde
pRZ18(18SrDNA) 97
4.4.1.2. RFLP-Analysen mit Sonde
pRZ25 (25S rDNA) 98
4.4.1.3. Vergleich der RFLP-Muster
der ribosomalen Sonden 100
Inhaltsverzeichnis
4.4.2. RFLP-Analysen mit Speicherprotein-Gen-Sonden 101
4.4.2.1. HMW-Glutenin-Gen-Sonde 1Ay 102
4.4.2.2. HMW-Glutenin-Gen-Sonde Bx17 103
4.4.2.3. HMW-Glutenin-Gen-Sonde By9 104
4.4.2.4. HMW-Glutenin-Gen-Sonde pTag1290 105
4.5. Ergebnisse der Analyse von Microsatelliten 108
5. Diskussion
5.1. Die Speicherproteine 114
5.1.1. Die Speicherproteine: allgemeine Betrachtungen 114
5.1.2. HMW-Subunits 115
5.1.3. Gesamtheit SDS-Iöslicher Proteine 116
5.1.4. LMW-Glutenine 117
5.1.5. Backqualität 118
5.1.6. Kartierung von Speicherprotein-Gen-Loci
des Dinkels 121
5.2. Speicherprotein-Gene 121
5.2.1. Speicherprotein-Gene: allgemeine Betrachtungen 121
5.2.2. Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten
Speicherprotein-Gen-Sonden 123
5.2.3. Polymerase Chain Reaction (PCR) 124
5.3. In s/ru-Hybridisierungen 125
5.4. RFLP-Analysen 127
5.5. Analysen von Microsatelliten 132
6. Zusammenfassung
Zusammenfassung 135
7. Literaturverzeichnis
Literaturverzeichnis 138
VI Inhaltsverzeichnis
8. Anhang
8.1. Geräte und Verbrauchsmaterial 158
8.2. Chemikalien 160
8.3. Pedigrees von Dinkelsorten 163
8.4. Anschriften von Dinkel-und Weizenzüchtern 164
8.5 Bezugsquellen der zugesandten Sonden 167
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