Untersuchungen verschiedener Lymphozytensubpopulationen, entsprechender regulatorischer Zytokine und Immunglobulinisotypen in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit bei Pferden mit chronisch obstruktiver Bronchitis (COB):
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| adam_text | Titel: Untersuchungen verschiedener Lymphozytensubpopulationen, entsprechender regulatorischer Zytokine und
Autor: Berendonk, Mechthild
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung_......14
2. Literaturübersicht_________16
2.1. Zellen der Immunantwort....................16
2.2. T-Lymphozyten.__.....................................17
2.2.1. Zytotoxische T-Lymphozyten...............................17
2.2.2. T-Helferzellen...........18
2.3. Oberfläcfaenantigene auf equinen Leukozyten______...___.._________________19
2.3.1. Equines CD4 (EqCD4)...........................19
2.3.2. Equines CD8 (EqCD8)......................21
2.4. Von T-Zellen produzierte Zytokine_________________________..........................23
2.4.1. Interieukin-2 (EL-2).................................24
2.4.2. Interferon-y (IFN-y)......................25
2.4.3. Interleukin-4 (IL-4)........................25
2.5. B-Liymphozyten...........................26
2.6. Immonglobuline.................................. 27
2.6.1. Struktur des Immunglobulinmoleküls..........29
2.6.2. Immunglobulinisotypen beim Pferd.............................30
2.6.3. Nachweisantikörper gegen equine Immunglobulinisotypen................................33
2.7. Zellen der angeborenen Immunität: Natürliche Killerzellen (ISK)____________34
2.8. Die chronisch obstruktive Bronchitis beim Pferd________37
2.8.1. Ätiologie der chronisch obstruktiven Bronchitis..................................................39
2.8.2. Abwehrmechanismen des Respirationstraktes beim Pferd...................................40
2.8.3. Histopathologische Befunde in der Lunge von COB-kranken Pferden...............42
2.8.4. Immunhistochemische Befunde in der Lunge von COB-kranken Pferden..........43
2.8.5. Bronchoalveoläre Lavage (BAL)..................44
2.8.6. Zytologische Befunde der Bronchiailavageflüssigkeit von lungengesunden und
COB-kranken Pferden...........................44
2.8.7. Immunphänotypische Untersuchungen von Lymphozyten im peripheren Blut und
aus der bronchoalveolären Lavage von lungengesunden und COB-kranken
Pferden..............47
2.8.8. Immunglobulingehalt in Tracheobronchialsekret und Bronchiallavageflüssigkeit
von COB-kranken Pferden..................50
3. Geräte, Material und Methoden____________________________________52
3.1. Geräte____________..52
3.2. Material_______________54
3.2.1. Verbrauchsmaterialien..........................................................................................54
3.2.2. Chemikalien und Reagenzien...............................................................................55
3.2.3. Antikörper und Konjugate, Referenzsubstanzen sowie bei der PCR verwendete
Plasmide und DNA-Proben..................................................................................58
3.2.4. Zellkulturmedium.................................................................................................60
3.2.5. Lösungen und Puffer............................................................................................60
3.2.6. Probandengut........................................................................................................70
33. Methoden.....................................................................................................................72
3.3.1. Klinische Untersuchung.......................................................................................72
3.3.1.1. Arterielle Blutgasanalyse.................................................................................75
3.3.1.2. Tracheobronchoskopie und Entnahme von Tracheobronchialsekret..............76
3.3.2. Einteilung der Probanden.....................................................................................78
3.3.3. Blutentnahme........................................................................................................79
3.3.3.1. Anfertigung und Färbung der Blut- und Bronchiallavagezellausstriche.........79
3.3.3.2. Untersuchung der Blutausstriche.....................................................................80
3.3.4. Blutzellseparation über einen Ficoll-Isopaque-Dichtegradienten........................81
3.3.5. Beurteilung von Zelldichte und Zellvitalität von Blut- und Bronchiallavagezellen
..............................................................................................................................82
3.3.6. Bronchoalveoläre Lavage (BAL).........................................................................83
3.3.6.1. Separation der Zellen aus der bronchoalveolären Lavage...............................84
3.3.7. Hamstoffbestinnnung aus Bronchiallavageflüssigkeit und Blutplasma...............84
3.3.8. Membranimmunfluoreszenzfärbung....................................................................86
3.3.8.1. Durchflußzytometrische Auswertung der Membranimmunfluoreszenz.........89
3.3.9. Präparation der RNA aus equinen PBMC- und BAL-Zellen...............................93
3.3.10. DNAse-Behandlung der isolierten Gesamt-RNA................................................94
3.3.11. Synthese der cDNA durch Reverse Transkriptions- (RT-) Reaktion...................95
3.3.12. Amplifikation der cDNA mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)..........96
3.3.13. DNA-Gelelektrophorese.....................................................................................100
3.3.14. Transfer von DNA mittels Kapillarblot-Technik nach Southem.......................101
3.3.15. Radioaktive Markierung von DNA-Proben........................................................102
3.3.16. Hybridisierung von DNA mit radioaktiv markierten DNA-Proben...................103
3.3.17. Autoradiographie................................................................................................104
3.3.18. Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)..............................................105
3.3.18.1. Standard-ELISA zur Bestimmung des Gesamtimmunglobulins................105
3.3.18.2. ELISA zur Bestimmung der Immunglobulinisotypen IgGa, IgGb, IgG(T),
IgAundlgM...............................................................................................108
3.3.18.3. Auswertung der ELIS A-Ergebnisse (Referenz-Standard-Methode)..........112
3.3.19. Statistische Auswertung der Ergebnisse.............................................................113
4. Ergebnisse...................................___....„.„.„......„„.......„„...„„„...__........__.... 114
4.1. Ergebnisse der Untersuchung des Respirationstraktes____________._______114
4.1.1. Klinische Befunde der Probanden......................................................................114
4.1.2. Bronchoskopische Befunde der Probanden........................................................117
4.1.3. Befunde der arteriellen Blutgasanalyse..............................................................117
4.1.4. Befunde der Tracheobronchialsekretanalyse......................................................120
4.1.5. Einteilung der Probanden in drei Gruppen aufgrund der erhobenen Parameter 120
4.2. Differentialblutbild.......__„...„.„„™.„____._____.„„„____._________„___125
4.3. Volumina, Zeflgehatt and Harnstoffgebalt der Bronchiallavageflüssigkeit___127
4.3.1. Ergebnisse der Harnstoffanalysen......................................................................127
4.3.2. Gewonnene Volumina und Zellgehalte..............................................................127
4.4. Differentialzellbild der bronchoalveoläreo Lavage (BAL)_________________129
4.5. DurchfluBzytometrische Charakterisierung von Lymphozyten in der
BronchiaDavage and im Blut-------------------------------------------------------------132
4.5.1. Oberflächenimmunglobulin-positiveLyinphozyten..........................................132
4.5.2. CD4- und CD8-positive Lymphozyten..............................................................137
4.5.3. Zusammenfassung der durchflußzytometrischen Messung................................142
4.6. Ergebnisse aus der Reversen-Transkriptase- (RT-) und Polymerase-Ketten-
ReaktioD (PCR)________________144
4.6.1. Nachweis von IL-2-, ÜL-4- und IFN-y-cDNA....................................................144
4.6.2. Nachweis der ce-Expression...............................................................................148
4.7. Ergebnisse aus dem Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)________150
4.7.1. Gesamtimmunglobulingehalt in Bronchiallavage und Plasma...........................150
4.7.2. Immunglobulinisotypen in Bronchiallavageflüssigkeit......................................152
4.7.3. Immunglobulinisotypen im Plasma....................................................................156
5ni«kii««inn____________..................... ...........................158
5.1. Aaswahl der Probanden--------------......................................................................159
5.2. Typ-I-Hypersensitrvität als eine Ursache für die chronisch obstruktive
Bronchitis des Pferdes?............................................................................................160
5.3. Vergleich der chronisch obstruktiven Bronchitis des Pferdes mit dem
Krankheitsbild des atopischen Asthma des Menschen.........................................163
5.3.1. Histopathoiogische Befunde...............................................................................163
5.3.2. Rolle der T-Lymphozyten in der Bronchiallavage.............................................164
5.3.3. Die Rolle von Gamma/delta-T-Zellen (yo-T-Zellen) bei atopischem Asthma... 165
5.3.4. B-Lymphoyzten in der Bronchiallavage............................................................168
5.3.5. Untersuchung des Zytoküimusters in Zellen aus der BAL................................168
5.3.6. Immunglobulinisotypen in der Bronchiallavage................................................170
5.3.7. Immunglobulin E in der Bronchiallavage..........................................................173
5.3.8. Abschließende Beurteilung................................................................................174
5.4. Schlußbemerkung_____________177
6. Zusajninenfassnng......... 178
7. Summary_________181
8. Literaturverzeichnis..........................................................................................184
9. Anhang________________.______......................................„.........................210
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