Semiquantitative Untersuchung von Zytokin mRNA Profilen bei Patienten mit Immunthyreopathien und nichtautoimmunen Schilddrüsenerkrankungen:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. MATERIAL UND METHODEN 9
2.1 MATERIALIEN 9
2.1.1 CHEMIKALIEN, ENZYME, ANTIKOERPER 9
2.1.2 LOESUNGEN UND PUFFER 9
2.1.3 PATIENTEN 10
2.1.3.1 MORBUS BASEDOW 10
2.1.3.2 HASHIMOTO THYREOIDITIS 10
2.1.3.3 UNIFOKALE THYREOIDALE AUTONOMIE 11
2.1.3.4 EUTHYREOTE STRUMA NODOSA 11
2.1.3.5 NORMALGEWEBE 11
2.2 METHODEN 13
2.2.1 ZELLTECHNIKEN 13
2.2.1.1 KULTUR UND STIMULATION PERIPHERER MONONUKLEAERER ZELLEN 13
2.2.1.2 PRAEPARATION VON GEWEBEN UND INTRATHYREOIDALEN ZELLPOPULATIONEN
13
2.2.2 METHODEN DER NUKLEINSAEUREANALYTIK 14
2.2.2.1 RNA-EXTRAKTION UND -ELEKTROPHORESE 14
22
.
2.2 QUANTITATIVE UND QUALITATIVE CHARAKTERISIERUNG DER RNA-PRAEPARATION
15
2.2.2.3 CDNA-SYNTHESE 16
2.2.2.4 GRUNDLAGEN DER POLYMERASEKETTENREAKTION 16
2.2.2.5 SEMIQUANTITATIVE PCR DURCH EINSATZ EINES INTERNEN STANDARDS 17
2.2.2.6 AUFBAU DER MULTISPEZIFISCHEN KONTROLLFRAGMENTE 19
2
.
2
.
2.1 PRIMER 20
2.2.2.8 AMPLIFIKATIONSREAKTION UND PROGRAMMKONFIGURATION 21
2
.
22.9 PCR-OPTIMIERUNG 22
2.2.2.10 QUANTIFIZIERUNG 23
2.2.3 NACHWEIS, IDENTIFIZIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON DNA 26
2.2.3.1 AGAROSE-ELEKTROPHORESE VON DNA 26
2.2.3.2 NICHTSEQUENZSPEZIFISCHE DETEKTION VON DNA 27
2.2.3.3 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.3.4 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 28
2.2.3.5 RADIOAKTIVE SEQUENZIERUNG VON PCR-PRODUKTEN 28
2.2.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE BESTIMMUNG DER THYREOIDALEN
T-LYMPHOZYTAEREN INFILTRATION 30
2.2.4.1 MARKIERUNG UND FAERBUNG 30
2.2.4.2 MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNG UND QUANTIFIZIERUNG 30
2.3 STATISTISCHE ANALYSEN 31
3. ERGEBNISSE 32
3.1 VORUNTERSUCHUNGEN 32
3.1.1 QUALITAETSKONTROLLE DER RNA-EXTRAKTION 32
3.1.2 ERGEBNISSE DER CDNA-SYNTHESE UND AEQUILLIBRIERUNG 32
3.1.3 SENSITIVITAETSUNTERSUCHUNGEN ZUR ERMITTLUNG DER AU 33
3.1.4 VERIFIZIERUNG DER UNTERSUCHTEN CDNA-MOIEKUELE 33
3.1.5 ZEITABHAENIGE SEMIQUANTITATIVE TRANSKRIPTIONS- UND
TRANSLATIONSANALYSE 33
3.1.6 IMMUNPHENOTYPISIERUNG INTRATHYREOIDALER ZELLPOPULATIONEN 35
3.1.7 ANALYSE DER THYREOIDALENT-LYMPHOZYTAEREN INFILTRATION 35
3.2. ANALYSE DER INTRATHYREOIDALEN ZYTOKIN MRNA-EXPRESSION 36
3.2.1 VERGLEICHENDE ANALYSE DER SPEZIFISCHEN MRNA-EXPRESSION 36
3.2.2 SEMIQUANTITATIVE MRNA-EXPRESSIONSANALYSE TH2-TRIGGEMDER ZYTOKINE
36
3.2.3 SEMIQUANTITATIVE MRNA-EXPRESSIONSANALYSE TH 1-TRIGGERNDER ZYTOKINE
38
3.2.4 ANALYSE DER MRNA-EXPRESSION VON ZYTOKINEN MIT
PRO / INFLAMMATORISCHER AKTIVITAET 39
3.2.5 ANALYSE DER TNF-A MRNA-EXPRESSION IN THYREOIDALEM GEWEBE 40
3.2.6 ANALYSE DER TNF-A MRNA-EXPRESSION THYREOIDALER ZELLPOPULATIONEN 40
3.2.7 NACHWEIS EINER ALTERNATIV GESPLEISSTEN IL-4 MRNA-VARIANTE IN
THYREOIDALEM GEWEBE 42
4. DISKUSSION 44
5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 61
6. LITERATURVERZEICHNIS 64
ANHANG |
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