Molekulargenetische Charakterisierung von Bakterien des Pasteurella pneumotropica-Komplexes und anderen nagerrelevanten Pasteurellaceen:
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Autor: Kirschnek, Susanne Bettina
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...........................................................................................................................1
2 Schrifttwn..........................................................................................................................3
2.1 Bakterienklassifikation......................................................................................................3
2.1.1. Aufgaben der Bakterienklassifikation.....................................................................4
2.1.2M6glichkeiten der Bakterienklassifikation...............................................................4
2.1.2.1 ,,Special purpose -Klassifikation/ Klassifikation fiir besondere Zwecke............4
2.1.2.2 Naturliche phenetische Klassifikation................................................................5
2.1.2.3 Naturliche phylogenetische Klassifikation.........................................................5
2.1.3 Methoden der Bakterienklassifikation......................................................................6
2.1.3.1 Phanotypische Methoden...................................................................................8
2.1.3.1.1 Numerische Taxonomie...............................................................................8
2.1.3.2 Chemotaxonomische Methoden.........................................................................9
2.1.3.2.1 Analyse von Proteinen..............................................................................10
2.1.3.2.2 Poly amine.................................................................................................10
2.1.3.2.3 Zellhullenanalyse......................................................................................11
2.1.3.2.4 Ganzzell-Analyse......................................................................................12
2.1.3.3 Molekulargenetische Methoden.......................................................................12
2 1.3.3.1 Guanin/Cytosin(G+C)-Gehaltsbestimmung..............................................12
2.1.3.3.2 Analyse der ribosomalen RNA..................................................................13
2.1.3.3.2.1 DNA-rRNA-Hyridisierung..................................................................13
2.1.3.3.2.2 Sequenzierung der 16S rRNA..........................................................14
2.1.3.3.3 DNA-DNA-Hybridisierung.......................................................................15
2 1.3.3.4 16S rRNA-Sequenzierung, DNA-DNA-Hybridisierung und das
Spezieskonzept........................................................................................................16
2.1.3.3.5 Auf DN A basierende Typisierung..............................................................17
2.1.3.3 5.1 RestriktionsanalysedergenomischenDNA.........................................18
2.1.3.3.5.1.1 Makrorestriktionsanalyse..................................................................18
2.1.3.3.5.2 Plasmidprofilanalyse...........................................................................18
2.1.3.3.5.3 Konventionelles Ribotyping................................................................18
2 1.3 3.5 4 Auf der Poiymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende
Typisierungsmethoden..........................................................................................19
2.1.3.3.5.4.1 Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR)................................................20
2.1.3 3.5.4.2 Auf repetitiven Sequenzen basierende PCR...................................20
2.1.3.3.5.4.3 ITS-PCR.......................................................................................21
2.1.3.3.5.4.4 rRNA-Gen-Amplifizierung und Restriktionsspaltung....................21
2.2 Die Familie Pasteurellaceae und ihre Bedeutung bei Nagetieren......................................22
2.2.1 Geschichte und Beschreibung der Familie Pasteurellaceae.....................................22
2.2.2 Vorkommen von Pasteurellaceen bei Nagetieren und ihre bisherige taxonomische
Einordnung....................................................................................................................23
2.2.2.1 Pastenrella prKumotropica-Kamp ex..............................................................23
2.2.2.2 ..Haemophilia influenzaemurium ..................................................................29
2.2.2.3 Pastenrella sp. RatteSchulz............................................................................30
2.2.2.4 Actinobacillus imiris........................................................................................30
2.2.2.5 Wachstumsfaktor-abhangige Isolate................................................................31
2.2.3 Die Bedeutung der Nagerpasteurellaceen...............................................................31
2.2.3.1 Der EinfluB der Mikroorganismen auf Tierversuche........................................31
2.2.3.2 Die pathogene Bedeutung von Bakterien des Pasteurellapneumotropica-
Komplexes und anderen Pasteurellaceen bei Ratte und Maus.......................................33
2.2.3.3 Vorkommen und pathogene Bedeutung von Bakterien des Pasteurella
pneumotropica-YLomplexes bei anderen Tierarten.........................................................35
2.2.3.4 Vorkommen und pathogene Bedeutung von Bakterien des Pasteurella
pneumotropica-K.omp exes beim Menschen..................................................................36
3 Material und Methode........................................................................................................37
3.1 Untersuchungsmaterial.......................................................................................................37
3.1.1 Bakterienstamme......................................................................................................37
3.1.2 Oligonukleotide........................................................................................................40
3.1.3 Fliissigmedien, Losungen und Puffer.......................................................................42
3.1.3.1 Fliissigmedien.....................................................................................................42
3.1.3.2 Allgemeine Losungen.........................................................................................42
3.1.3.3 Puffer..................................................................................................................44
3.1.4 Chemikalien und Enzyme.........................................................................................45
3.1.4.1 Enzyme...............................................................................................................46
3.1.4.2 Molekularbiologische Chemikalien...................................................................46
3.1.5 Sonstige Materialien.................................................................................................46
3.1.6 Computersoftware.....................................................................................................46
3.2Methoden............................................................................................................................47
3.2.1 Bakterienanziichtung................................................................................................47
3.2.2 Phanotypische Charakterisierung.............................................................................47
3.2.3 Bakterienanziichtung fur die Maxi-Praparation von Bakterien-DNA......................49
3.2.4 Preparation der genomischen Bakterien-DNA.........................................................49
3.2.4.1 Lyse der Zellen...................................................................................................49
3.2.4.2 Reinigung und Fallung der DNA.......................................................................50
3.2.4.3 Mini-Praparation von Bakterien-DNA...............................................................50
3.2.4.4 Quantitat und Qualitat der DNA-Losungen.......................................................51
3.2.5 Agarosegel-Elektrophorese.......................................................................................51
3.2.6 16S rRNA-Genamplifizierung und Sequenzierung..................................................52
3.2.6.1 PCR zur Ampiifizierung des 16SrRNA-Gens...................................................53
3.2.6.2 Reinigung der PCR-Produkte.............................................................................54
3.2.6.3 Kontrolle der PCR-Produkte in Agarosegelen...................................................54
3.2.6.4 5 -Endmarkierung der Sequenzieningsprimer...................................................55
3.2.6.5 Direkte Sequenzierung der PCR-Produkte.........................................................55
3.2.6.6 Vertikale Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Sequenzierungsprodukte........56
3.2.6.7 Auswertung der Autoradiogramme....................................................................57
3.2.7 DNA-DNA-Hybridisierung......................................................................................57
3.2.7.1 Vorbehandlung der DNA...................................................................................58
3.2.7.2 Jtandom Primed DNA-Markierung................................................................58
3.2.7.3 Abtrennung nicht eingebauter Radionuklide......................................................59
3.2.7.4 Reassoziation......................................................................................................60
3.2.7.5 Sl-Nuklease-Verdau..........................................................................................61
3.2.8 Arbitrarily Primed Polymerase Kettenreaktion (AP-PCR)......................................61
3.2.8.1 Ampiifizierung...................................................................................................61
3.2.8.2 Darstellung und Auswertung der AP-PCR-Produkte.........................................63
3.2.9 Internally Transcribed Spacer Polymerase Kettenreaktion (TTS-PCR)....................63
3.2.9.1 Ampiifizierung...................................................................................................64
3.2.9.2 Darstellung der PCR-Produkte...........................................................................64
4 Ergebnisse............................................................................................................................65
4.1 Phanotypische Charakterisierung.......................................................................................65
4.2 16SrRNA-Sequenzierung..................................................................................................75
4.2.1 Pasteurella pneumotropica-Yiomptex......................................................................77
4.2.1.1 Pasteurella pneumotropica Y zy ........................................................................77
4.2.1.2 Pasteurella pneumotropica Jawetz-Gruppe.......................................................77
4.2.2 ,Jiaemophilus injIuenzaemurium /ActinobailIus muris/Pasteurellasp. Ratte-
Komplex............................................................................................................................77
4.2.3 ,,Past31 -Gruppe.......................................................................................................79
4.2.4 Pasteurella multocida sbsp. ^fl//ic/V/a-ahnliches Isolat............................................79
4.2.5 Vergieich der von Nagern stammenden Pasteurellaceen-Sequenzen im Hinblick auf
Signatursequenzbereiche...................................................................................................81
4.3 DNA-DNA-Hybridisierung................................................................................................84
4.3.1 Pasteurella pneumotropica-Komp ex......................................................................84
4.3.1.1 Pasteurella pneumotropica Heyl........................................................................84
4.3.1.2 Pasteurella pneumotropica Jawetz-Gruppe.......................................................85
4.3.2 ,,Haemophilus influenzaemurium ...........................................................................85
4.3.3 Actinobacillus muris.................................................................................................85
4. 4AP-PCR.............................................................................................................................88
4.4.1 Pasteurella pneumotropica-Komp ex......................................................................89
4.4.1.1 Pasteurella pneumotropica Heyl........................................................................89
4.4.1.2 Pasteurella pneumotropica Jawetz-Gruppe.......................................................91
4.4.2 ,Jiaemophilus influenzaemurium ...........................................................................95
4.4.3 Pasteurella sp. Ratte.................................................................................................95
4.4.4 Actinobacillus mura-Gruppen..................................................................................97
4.4.5 ,,Past31 -Gruppe.......................................................................................................98
4.4.6 ,!Past32 -Gruppe.......................................................................................................99
4.4.7 Pasteurella multocida sbsp. gaffirida-ahnliche Gruppe...........................................99
4.5ITS-PCR...........................................................................................................................101
5 Diskussion..........................................______......................_______________...............105
5.1 I6SrRNA-Sequenzierung................................................................................................105
5.2 DNA-DNA-Hybridisierung..............................................................................................109
5.3AP-PCR............................................................................................................................112
5.4ITS-PCR...........................................................................................................................115
5.5 Pasteurellapneumotropica-Komplex..............................................................................116
5.5.1 Pasteurella pneumotropica Jawetz-Gruppe...........................................................117
5.5.2 Pasteurella pneumotropica Heyl............................................................................118
5.5.3 Konsequenzen fur die taxonomische Einordnung des Pasteurella pneumotropica-
Komplexes.......................................................................................................................121
5.6 ,Ji. influenzaemurium /P. sp. Rattej Actinobacillus muTO-Komplex..............................122
5.6.1 ,Jiaemophilus- influenzaemurium .........................................................................122
5.6.2 Pasteurella sp. Ratte...............................................................................................124
5.6.3 Actinobacillus muris...............................................................................................125
5.7 Pasteurella multocida sbsp. gallicida..............................................................................126
5.8 JJast31 -Gruppe..............................................................................................................127
5.9 ,J ast32 -Gruppe..............................................................................................................127
5.10 Isolate mit ungeklarter Zugehorigkeit............................................................................128
5.11 Phanotypische Minimalkriterien zur Identifizierung und Differenzierung der
Pasteurellaceen bei Ratte und Maus.......................................................................................128
5.12 Vorkommen von Pasteurellaceen bei Wildnagern.........................................................131
5.13 Wirtsspezifitat bei Nagerpasteurellaceen.......................................................................132
6 Zusammenfassung.............................................................................................................135
7 Literaturverzeichnis--------..........................„....................................................................141
8 Anhang—..........................................................................................................................163
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