Analyse von Anti-Endothelzell-Antikörpern sowie vitronektin- und fibronektinhaltiger Immunkomplexe bei den primären systemischen Vaskulitiden Wegener-Granulomatose und Churg-Strauss-Syndrom:
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| Published: |
Aachen
Shaker
2000
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|
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
J
1.1
VASKULITIS
.
1
1.2
AUTOIMMUN
BEDINGTE
VASKULITIDEN
.
2
1.2.1
WEGENER-GRANULOMATOSE
.
3
1.2.2
CHURG-STRAUSS-SYNDROM
.
6
1.3
ANTI-ENDOTHELZELL-ANTIKOERPER
(AECA)
.
6
1.4
VORARBEITEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
VON
ENDOTHELIALEN
AUTOANTIGENEN
.
8
1.5.
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
.
10
1.5.1
UNTERSUCHUNGEN
VON
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
10
1.5.2
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DEN
EIGENSCHAFTEN
DER
AECA
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
.
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
3
2.1
PUFFERZUSAMMENSETZUNGEN
.
13
2.2
SERUM
.
13
2.3
UNTERSUCHUNGEN
VON
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
14
2.3.1
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
FIBRONEKTIN
.
14
2.3.1.1
IMMUNISIERUNG
.
14
2.3.1.2
ZELLKULTUR
.
14
2.3.1.3
TESTEN
DER
KULTURUEBERSTAENDE
.
18
2.3.1.4
ISOTYPBESTIMMMUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
18
2.3.1.5
REINIGUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
19
2.3.1.6
BESTIMMUNG
VON
ANTIKOERPERKONZENTRATIONEN
.
19
2.3.1.7
KOPPLUNG
UND
MARKIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
.
20
2.3.2
KOOPERATIVER
BINDUNGSTEST:
NACHWEIS
VON
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
IN
HUMANSEREN
.
22
2.3.2.1
SUBKLASSENBESTIMMUNG
DER
IN
IMMUNKOMPLEXEN
GEBUNDENEN
ANTIKOERPER
.
25
2.3.3
BINDUNG
VON
HUMANEN
ANTIKOERPERN
AN
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTIN
.
26
2.3.4
KOMPETITIONSTEST
VON
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
DURCH
LOESLICHES
FIBRONEKTIN
ODER
HEPARIN
.
26
2.3.5
ADSORPTION
VON
IMMUNKOMPLEXEN
.
27
2.3.5.1
ADSORPTION
FIBRONEKTINHALTIGER
IMMUNKOMPLEXE
.
27
2.3.5.2
ADSORPTION
VON
IMMUNKOMPLEXEN
AN
ENDOTHELZELLEN
/
BESTIMMUNG
VON
AECA
IM
ZELL-ELISA
.
27
2.3.6
UEBERPRUEFUNG
DES
VORKOMMENS
VON
VITRONEKTIN
IN
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
28
2.3.7
BINDUNG
VON
IMMUNKOMPLEXEN
AN
HEPARIN/BSA
.
28
2.3.8
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
VON
FIBRONEKTIN
IM
SERUM
.
28
2.3.9
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
VON
VITRONEKTIN
IM
SERUM
.
29
2.3.10
TRENNUNG
DER
IMMUNKOMPLEXE
VON
DEN
UEBRIGEN
SERUMKOMPONENTEN
MITTELS
GELFILTRATION
/
FPLC
(FAST
PROTEIN
LIQUID
CHROMATOGRAPHY)
.
30
2.4
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DEN
EIGENSCHAFTEN
DER
AECA
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
.
31
2.4.1
UNTERSUCHUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
MITTELS
WESTERN
BLOT
.
31
2.4.1.1
ZELLINIEN
.
31
2.4.1.2
GEWINNUNG
VON
HUVEC
.
31
2.4.1.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
/
WESTERN
BLOT
.
32
2.4.2
UNTERSUCHUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
MITTELS
EINER
PHAGEN-EXPRESSIONS
CDNA-BIBLIOTHEK
.
36
2.4.2.1
HERSTELLUNG
DER
CDNA-BIBLIOTHEK
.
36
2.4.2.2
KLONIERUNG
IN
T7-PHAGEN
.
39
2.4.2.3
ANREICHERUNG
GESUCHTER
PHAGEN
(BIOPANNING)
/
PLAQUE-TEST
.
41
2.4.2.4
SEQUENZIERUNG
POSITIVER
PHAGENKLONE
.
43
2.5
STATISTIK
.
44
3
ERGEBNISSE
._
.
45
3.1
UNTERSUCHUNGEN
VON
VITRONEKTIN-UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
45
3.1.1
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
FIBRONEKTIN
.
45
3.1.2
SERUMMARKER
VON
PATIENTEN
UND
GESUNDEN
.
45
3.1.2.1
KOOPERATIVER
BINDUNGSTEST:
MESSUNG
VON
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
45
3.1.2.2
SUBKLASSENBESTIMMUNG
DER
IN
DEN
IMMUNKOMPLEXEN
GEBUNDENEN
ANTIKOERPER
.
52
3.1.2.3
BINDUNG
VON
HUMANEN
ANTIKOERPERN
AN
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTIN
.
54
3.1.2.4
VERDRAENGUNG
FIBRONEKTINHALTIGER
IMMUNKOMPLEXE
DURCH
LOESLICHES
FIBRONEKTIN
.
55
3.1.2.5
ADSORPTION
VON
IMMUNKOMPLEXEN
DURCH
IMMUNPRAEZIPITATION
ODER
DURCH
WECHSELWIRKUNG
MIT
ENDOTHELZELLEN
.
56
3.1.2.6
UEBERPRUEFUNG
DES
VORKOMMENS
VON
VITRONEKTIN
IN
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
ZEIGT
GEMEINSAMES
AUFTRETEN
DER
IMMUNKOMPLEXE
.
58
3.1.2.7
BINDUNG
VON
IMMUNKOMPLEXEN
AN
HEPARIN
/
VERDRAENGUNG
VON
IMMUNKOMPLEXEN
DURCH
HEPARIN
.
59
3.1.2.8
TRENNUNG
DER
IMMUNKOMPLEXE
VON
DEN
UEBRIGEN
SERUMKOMPONENTEN
.
60
3.1.2.9
ZUSAMMENSETZUNG
DER
IMMUNKOMPLEXE
.
62
3.1.2.10
KONZENTRATION
VON
FIBRONEKTIN
UND
VITRONEKTIN
IM
SERUM
.
65
3.1.2.11
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
ZU
DEN
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
66
3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DEN
EIGENSCHAFTEN
DER
AECA
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
.
68
3.2.1
UNTERSUCHUNG
VON
AECA-AUTOANTIGENEN
MITTELS
WESTERN
BLOT
.
68
3.2.1.1
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ANALYSE
VON
AECA-ANTIGENEN
IM
WESTERN
BLOT
.
71
3.2.2
UNTERSUCHUNG
VON
AECA-AUTOANTIGENEN
MITTELS
EINER
PHAGEN-EXPRESSIONS
CDNA-BIBLIOTHEK
.
72
3.2.2.1
UEBERPRUEFUNG
DER
QUALITAET
DER
PHAGEN-BIBLIOTHEK
.
73
3.2.2.2
POSITIVKONTROLLVERSUCH:
ANREICHERUNG
VON
PHAGEN,
DIE
DEN
VON
WILLEBRAND
FAKTOR
ODER
TEILE
DAVON
IN
IHRER
HUELLE
TRAGEN
.
74
3.2.2.3
ANREICHERUNG
VON
PHAGEN,
DIE
DURCH
ANTIKOERPER
AUS
PATIENTENSEREN
ERKANNT
WERDEN
.
75
3.2.2.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
ANALYSE
VON
AECA-ANTIGENEN
DURCH
EINE
PHAGEN-EXPRESSIONS
CDNA-BIBLIOTHEK
.
77
VIII
4
DISKUSSION
79
4.1
UNTERSUCHUNG
VON
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXEN
.
79
4.1.2
ASSOZIATION
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGER
IMMUNKOMPLEXE
MIT
VERSCHIEDENEN
ERKRANKUNGEN
.
79
4.1.2.1
EIGENSCHAFTEN
DES
VITRO-UND
FIBRONEKTINS
.
81
4.1.3
EIGENSCHAFTEN
DER
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXE
.
84
4.1.4
ZUSAMMENSETZUNG
DER
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXE.
.
86
4.1.5
WECHSELWIRKUNGEN
DER
VITRONEKTIN
UND
FIBRONEKTINHALTIGEN
IMMUNKOMPLEXE
MIT
DEM
ENDOTHEL
.
89
4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DEN
EIGENSCHAFTEN
DER
AECA
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
.
90
4.2.1
UNTERSUCHUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
MITTELS
WESTERN
BLOT
.
90
4.2.2
UNTERSUCHUNG
VON
AECA-ANTIGENEN
MITTELS
EINER
PHAGEN-EXPRESSIONS
CDNA-BIBLIOTHEK
.
92
5 ZUSAMMENFASSUNG
95
6 LITERATUR |
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