Die Steuerung des Sink-Source-Übergangs während der Blattentwicklung von Arabidopsis thaliana: molekularbiologische Analysen des AtSUC2-Promotors und der Rolle von Plasmodesmata
Gespeichert in:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
.
1
2
ERGEBNISSE
.
11
2.1.
ATSUC2
-
EIN
SACCHAROSETRANSPORTER
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
11
2.1.1.
EXPRESSION
DES
GRUENFLUORESZIERENDEN
PROTEINS
(GFP)
UNTER
DER
KONTROLLE
DES
GELEITZELLEN
UND
SOURCESPEZIFISCHEN
PROMOTORS
VON
ATSUC2
.
11
2.1.1.1.
HERSTELLUNG
DES/FRSUC?
PROMOTOR-GPP
KONSTRUKTS
PEPL
.
11
2.1.1.2.
EXPRESSION
DES
GFP-GENS
IN
TRANSGENEN
ATSUC2
PROMOTOR-GPP
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
12
2.1.1.2.1.
GEWEBS
UND
ENTWICKLUNGSSPEZIFISCHE
VERTEILUNG
DES
GFP
.
12
2.1.1.2.2.
GFP
AUS
ATSUC2
PROMOTOR-GPP
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
IM
SDS-POLYACRYLAMIDGEL
DETEKTIERBAR
.
15
2.1.1.3.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DES
ATSUC2
PROMOTOR-GPP
KONSTRUKTS
IN
NICOTIANA
TABACUM
.
16
2.1.1.4.
ANALYSE
DES
ASSIMILATSTROMS
IN
J/SUC?
PROMOTOR-GPP
PFLANZEN
.
17
1
2.1.1.4.1.
PFROPFEXPERIMENTE
MIT
TABAK-PFLANZEN
.
17
2.1.1.4.1.1.
SINKBLATT
VOM
GEPFROPFTEM
WILDTYP
UND
QUERSCHNITTE
DURCH
DEN
BLATTSTENGEL
.
17
2.1.1.4.1.2.
WESTEMBLOT-ANALYSE
VON
GFP
IM
WILDTYP-PFROEPFLING
.
18
2.1.1.4.2.
SINKSPEZIFISCHE
AKKUMULATION
VON
GFP
.
19
2.1.1.4.3.
ANALYSE
DER
GFP-FLUORESZENZ
IM
TAGESGANG
.
21
2.1.1.5.
NACHWEIS
DER
SYMPLASTISCHEN
ENTLADUNG
VON
PHLOEMMOBILEM
GFP
IN
AISUC2
PROMOTOR-GPP
PFLANZEN
.
23
2.1.1.5.1.
NACHWEIS
VON
GFP
AUSSERHALB
DES
LEITGEWEBES
.
23
2.1.1.6.
NACHWEIS
EINES
VERAENDERTEN
SYMPLASTISCHEN
TRANSPORTS
WAEHREND
DER
ENTWICKLUNG
DER
PLASMODESMATA
MITTELS
ATSUC2
PROMOTOR-GPP
PFLANZEN
.
27
2.1.2.
UNTERSUCHUNG
DER
GENREGULATION
DES
GELEITZELLEN
UND
SOURCESPEZIFISCHEN
SACCHAROSE/H
+
-SYMPORTERS
ATSUC2
.
29
2.1.2.1.
SUCHE
NACH
CIS-ELEMENTEN
IM
?F/SUC2-PROMOTORBEREICH
MIT
DEM
GFP
REPORTER
IN
PLANTA
.
29
2.1.2.1.1.
HERSTELLUNG
VON
SIEBEN
ATSUC2
PROMOTOR-GPP
KONSTRUKTEN
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
5
'-SEQUENZEN
DES
ATSUC2
.
29
2.1.2.1.2.
ANALYSE
DER
GFP-EXPRESSION
IN
DEN
TRANSGENEN
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
MIT
VERKUERZTEN
PROMOTORBEREICHEN
.
30
2.1.2.2.
IDENTIFIKATION
VON
CIS-ELEMENTEN
IM
PROMOTORBEREICH
DES
ATSUC2
IN
IN
VITRO
EXPERIMENTEN
.
32
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.2.2.1.
GELSHIFLEXPERIMENTE
.
32
2.1.2.2.1.1.
DNA-SONDEN
.
32
2.I.2.2.I.2.
AUTORADIOGRAMME
DER
RETARDIERUNGSEXPERIMENTE
UND
KOMPETITIERUNGSVERSUCHE
.
34
2.1.2.3.
ANALYSE
DER
REGULATORISCHEN
FUNKTION
DES
INTERAGIERENDEN
PROMOTOR
BEREICHS
MITTELS
MINIMALPROMOTER
UND
GUS-REPORTER
IN
PLANTA
.
40
2.2.
ATSUC4
EIN
SACCHAROSETRANSPORTER
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
42
2.2.1.
EXPRESSION
DES
GFP-GENS
UNTER
DER
KONTROLLE
DES
ATSUC4
PROMOTORS
.
42
2.2.1.1.
ANALYSE
DER
GPP-EXPRESSION
IN
DEN
TRANSGENEN
SUG4
PFLANZEN
.
43
2.2.2.
HERSTELLUNG
UND
PHAENOTYPISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
4/SL/C4-ANTISENSEPFLANZEN
.
47
2.3.
CKHUP2
EIN
HEXOSETRANSPORTER
AUS
CHLORELLA
KESSLERI
.
48
2.3.1.
EXPRESSION
DES
GFP
DURCH
INDUKTION
DES
CWFL7P2-PROMOTORS
MIT
MONOSACCHARIDEN
IN
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
48
2.3.1.1.
HERSTELLUNG
DES
CWGP2
PROMOTOR-GPP
KONSTRUKTS
HUG2
.
48
2.3.1.2.
ANALYSE
DER
INDUZIERBARKEIT
DES
CKHUP2
PROMOTORS
IM
HETEROLOGEN
SYSTEM
ARABIDOPSIS
.
49
2.4.
NTMSTL
-
EIN
MONOSACCHARIDTRANSPORTER
AUS
NICOTIANA
TABACUM
.
52
2.4.1.
HERSTELLUNG
UND
PHAENOTYPISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
MA/S77-ANTISENSEPFLANZEN
.
52
3
DISKUSSION
.
56
3.1.
ATSUC2
.
56
3.1.1.
A/SUC2
PROMOTER-GFP
PFLANZEN
.
56
3.1.1.1.
AISUC2
PROMOTOR-GPP
PFLANZEN
IM
VERGLEICH
ZU
ATSUC2
PROMOTOR
GUS
PFLANZEN
.
56
3.1.1.2.
UNTER
DER
KONTROLLE
DES
4TSUC2-PROMOTOR
EXPRIMIERTES
27
KD
GFP
IST
PHLOEMMOBIL
.
57
3.1.1.3.
PHLOEMMOBILES
GFP
WIRD
SYMPLASTISCH
ENTLADEN
.
59
3.1.1.4.
LOESLICHES
GFP
ALS
MARKER
FUER
DIE
DURCHLASSGROESSE
DER
PLASMODESMATA
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN
UND
UNTERSCHIEDLICHEN
ENTWICKLUNGS
ABSCHNITTEN
.
61
3.1.2.
GENREGULATION
IM
ATSUC2
PROMOTORBEREICH
.
64
3.1.2.1.
IDENTIFIKATION
DES
PROMOTORBEREICHS
DER
FUER
DIE
AKTIVIERUNG
DER
GFP
EXPRESSION
AUSREICHEND
IST
.
64
3.1.2.2.
MOEGLICHE
REGULATORBINDESTELLEN
IM
PROMOTORBEREICH
VON
ATSUC2
.
65
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.
ATSUC4
.
70
3.2.1.
UNTER
DER
KONTROLLE
DES
ATSUC4
PROMOTORS
WIRD
GFP
IM
HYPOKOTYL
EXPRIMIERT
UNTERDRUECKT
SACCHAROSE
DIE
HYPOKOTYL-ELONGATION?
.
70
3.2.2.
PHAENOTYP
DER
ARABIDOPSIS
ATSUC4-ANTISENSEPFLANZEN
.
72
3.3.
CKH(JP2
.
72
3.3.1.
CKHVP2
PROMOTER-GFP
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
-
INDUZIERBARKEIT
EINES
ALGEN
PROMOTORS
IN
EINER
HOEHEREN
PFLANZE
.
72
3.4.
NTMSTL
.
73
3.4.1.
PHAENOTYP
DER
TABAK
MASS77-ANTISENSENSEPFLANZEN
.
73
4
MATERIAL
UND
METHODEN
.
75
4.1.
MATERIAL
.
75
4.1.1.
ORGANISMEN
.
75
4.1.2.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
75
4.1.3.
ENZYME,
CHEMIKALIEN
UND
GERAETE
.
76
4.1.4.
OLIGONUKLEOTIDE
.
76
4.2.
METHODEN
.
77
4.2.1.
ANZUCHT
DER
ORGANISMEN
.
77
4.2.1.1.
BAKTERIEN
.
77
4.2.1.2.
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
78
4.2A.'I.NICOTIANATABACUM
.
78
4.2.2.
DNA-KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
78
4.2.2.1.
ALLGEMEINE
TECHNIKEN
ZUR
HERSTELLUNG
UND
ANALYSE
VON
PLASMIDEN
.
78
4.2.2.1.1.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
79
4.2.2.2.
HERSTELLUNG
VON
PROMOTOR
SUBKLONEN
UND
REPORTERKONSTRUKTEN
.
79
4.2.2.3.
HERSTELLUNG
VON
PFLANZENTRANSFORMATIONSKONSTRUKTEN
.
82
4.2.2.4.
HERSTELLUNG
VON
ATSUC2
PROMOTER
DELETIONEN
.
83
4.2.2.5.
HERSTELLUNG
VON
PLASMIDEN
FUER
GELSHIFT-SONDEN
.
83
4.2.2.6.
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIENZELLEN
UND
TRANSFORMATION
.
84
4.2.2.7.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
.
84
4.2.3.
SEQUENZANALYSE
.
84
4.2.3.1.
SEQUENZIERUNG
.
84
4.2.3.2.
ANALYSE
.
84
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.4.
PFLANZENTRANSFORMATION
.
85
4.2.4.1.
ARABIDOPSIS
THALIANA
TRANSFORMATION
.
85
4.2.4.2.
TABAK
TRANSFORMATION
.
87
4.2.4.3.
LISTE
TRANSGENER
PFLANZEN
.
87
4.2.5.
DETEKTION
VON
GFP
.
88
4.2.6.
GEWINNUNG
LOESLICHER
PROTEINE
UND
DES
GFPS
AUS
PFLANZENMATERIAL
.
89
4.2.7.
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
.
89
4.2.7.1.
WESTERN
BLOT
UND
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
.
89
4.2.7.2.
DIREKTE
DETEKTION
VON
GFP
IM
PAA-GEL
.
89
4.2.8.
GELSHIFT-ASSAYS
.
90
4.2.8.1.
HERSTELLUNG
VON
KEMPROTEINEXTRAKTEN
AUS
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
.
90
4.2.8.2.
HERSTELLUNG
DER
RADIOAKTIVMARKIERTEN
DNA-SONDEN
.
91
4.2.8.3.
BINDEREAKTION
.
92
4.2.8.4.
AUFTRENNUNG
DER
DNA
UND
DNA-PROTEINKOMPLEXE
IN
NATIVEM
PAA-GEL
UND
DETEKTION
.
92
4.2.9.
STAERKEFAERBUNG
VON
ARABDOPSIS
OEKOTYP
COLUMBIA
24
PFLANZEN
.
93
4.2.10.
GUS-AKTIVITAETSTEST
MIT
DEM
SUBSTRAT
X-GLUC
.
93
4.2.11.
INDUZIERUNG
EINES
INDUZIERBAREN
PROMOTORS
DURCH
MONOSACCHARIDE
IM
MEDIUM
.
93
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
94
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
96
ANHANG
.
108 |
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