Die Rolle des Proto-Onkogens c-myc bei der Aktivierung des Zellzyklus in Burkitt-Lymphom-Zellen: Studien in B-Zellen mit konditionaler myc-Funktion
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
1
1.
PROBLEMSTELLUNG
1
1.1
STAND DER
FORSCHUNG
IN
UEBERSICHT
1
1.2
ZIELE
DER
ARBEIT
3
2.
DAS
PROTO-ONKOGEN
C-MYC
4
3.
DER
ZELLZYKLUS
1
4.
DAS BURKITT-LYMPHOM
11
5.
DAS
EPSTEIN-BARR-VIRUS
13
II.
MATERIAL
17
1.
ZELLEN
17
1.1
HUMANE
B-ZELLEN
17
1.1.1
LYMPHOBLASTOIDE
ZELLINIEN
(LCL)
17
1.1.2
BURKITT-LYMPHOM-LINIEN
17
1.2
ESCHERICHIA
COLI
18
2.
EXPRESSIONSPLASMIDE
19
3.
ENZYME
20
4.
PCR-PRIMER
20
4.1
5
'
-PRIMER
20
4.2
3'-PRIMER
20
5.
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
20
6.
DNA-SONDEN
21
7.
ANTIKOERPER
21
7.1
PRIMAERE
ANTIKOERPER
21
7.2
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
22
8.
REAKTIONSSYSTEMC
(
'
KITS
'
)
22
9.
CHEMIKALIEN
UND
SONSTIGES
MATERIAL
23
IN.
METHODEN
25
1.
KULTIVIERUNG,
MANIPULATION
UND
ANALYSE
VON
ZELLEN
25
1.1
HUMANE
B-ZELLEN
25
1.1.1
KULTIVIERUNG
25
1.1.2
AUFBEWAHRUNG
25
1.1.3
BESTIMMUNG
DER
ZELLDICHTE
26
1.1.4
TRANSFEKTION
26
1.1.5
ANALYSE
DER
ZELLZYKLUS-VERTEILUNG
27
1.1.6
INDUKTION
DES
LYTISCHEN
ZYKLUS
IN
EBV-POSITIVEN
ZELLEN
27
1.2
ESCHERICHIA
COLI
28
1.2.1
KULTIVIERUNG
28
1.2.2
AUFBEWAHRUNG
28
1.2.3
GEWINNUNG
TRANSFORMATIONS-KOMPETENTER
BAKTERIEN
28
1.2.4
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
,
29
2.
ANALYSE
VON
DNA
UND
RNA
29
2.1
DNA
29
2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
29
2.1.2
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
29
2.1.3
RESTRIKTION
VON
DNA
29
2.1.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
30
2.1.5
SOUTHERN-BLOT
30
2.1.6
PCR
31
2.2
RNA
32
2.2.1
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
B-ZELLEN
32
2.2.2
BESTIMMUNG
DER
RNA-KONZENTRATION
32
2.2.3
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
32
2.2.4
NORTHERN-BLOT
33
2.2.5
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
34
3.
ANALYSE
VON
PROTEINEN
34
3.1
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
B-ZELLEN
34
3.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEIN-KONZENTRATION
34
3.3
POLYACRYLAMID-GELELKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
(PAGE)
35
3.4
WESTERN-BLOT
35
3.5
IMMUNOPRAEZIPITATION
36
3.6 ANALYSE DER
HISTON
HL-KINASE-AKTIVITAET
IN
IMMUNOPRAEZIPITATEN
36
IV.
ERGEBNISSE
38
1.
ETABLIERUNG
DER
B-ZELLINIE
P493-6
38
2.
MYC
WIRD
IN
P493-6-ZELLEN
KONDITIONAL
EXPRIMIERT
40
3.
P493-6-ZELLEN
EXPRIMIEREN
BL-TYPISCHE
MERKMALE
42
4.
EBNA1
WIRD
IN
P493-6-ZELLEN
VOM
PROMOTOR
CP
EXPRIMIERT
43
5.
P493-6-ZCLLEN
PROLIFERIEREN
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
MYC
48
6.
MYC
IST
ZUR
PROGRESSION
DURCH
G
1
NOETIG
49
7.
MYC
INDUZIERT DIE
EXPRESSION
VON
ZELLZYKLUS-AKTIVATOREN
50
8.
MYC
BEEINFLUSST
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
UND
EXPRESSION
VON
'
POCKET
'
-PROTEINEN
52
9.
DIE
ZELLZYKLUS-INHIBITOREN
PL6,
P21,
P27
UND
P57
WERDEN
NACH
REPRESSION
VON
MYC
NICHT INDUZIERT
53
10.
EKTOPISCHE
EXPRESSION
VON
CYCIIN
E
HEBT
DEN
ZELLZYKLUS-ARREST
NICHT
AUF
55
11.
MYC
NEUTRALISIERT
DIE
ANTIPROLIFERATIVEN
EFFEKTE
VON
EKTOPISCH
EXPRIMIERTEM
PL6
UND
P27
NICHT
57
12.
P27
WIRD IN
BL-LINIEN
DER
GRUPPE
I
REPRIMIERT
59
13.
P27
ASSOZIIERT
IN
BL-ZELLEN
MIT
CDK2
61
V.
DISKUSSION
63
1.
DIE
B-ZELLINIE
P493-6:
EIN
BL-MODELL
MIT
REGULIERBARER
MYC-FUNKTION
63
2.
MYC
INDUZIERT
CYCIIN
D
UND
CDK4
65
3. MYC
INDUZIERT
CYCIIN
E
66
4.
MYC
INAKTIVIERT
'
POCKET
'
-PROTEINE
67
5.
EBV
INAKTIVIERT
P27
68
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
72
VII.
LITERATUR
75
VIII.
ABKUERZUNGEN
90 |
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