Oberflächenplasmonresonanz: Entwicklung optimierter Applikationen im Vergleich zweier Systeme zur Messung biomolekularer Wechselwirkungen
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG.
.1
1 1 OBERF1.AECHENPLASMONRF.SONANZ BZW. SURFACK PL-ASMON RESONANZ: (SPR).2
1.2 INFORMATIONSGEHALT HINHS SL-INST )R(IRAMMS.5
1.3 VORAUSSETZUNGEN FUER SPR-MESSUNGEN.9
1.4 AUFBAU EINES SENSORCHIPS.12
1.5 ZIHI. DER ARBEIT.14
2 MATERIAL UND METHODEN.16
2.1 SPR-MESSUNGEN.16
2.1.1 AUFBAU DES BIACORE 2000
.16
2.1.2 AUFBAU DES IPHT-SYSTEMS
.17
2.1.3 UISUNGEN FUER SPR-MESSUNGEN
. 20
2.1.4 PROHENAUFTRAG
.20
2.1.5 TYPISCHER ABLAUF EINER UEN-LINE-MESSUNG AM IPHT-SYSTEM
.21
2.1.6 IMMOBILISIERUNG
.22
2
1
.
6
.
1 AMINOKOPPLUNG.22
2.1.6.2 IMMOBILISIERUNG VON HIS ,-TAG-PROTCINCN.22
2.1.7 MESSUNG VON ENDOPROTEASE-AKTIVITAET
.23
2
.1 7 1 ENZYME UND LOESUNGEN.23
2.1.7.2 DURCHFUEHRUNG.23
2.1.7.3 DATCNPROZCSSICRUNG. 24
2.2 ANZUCHT UND ERNTE VON BAKTERIEN I UR KLONIERUNG, EXPRESSION UND
SPR-ANALYTIK.24
2.3 TABELLARISCHE ZUSAMMENFASSUNG VERWENDETER ANTISEREN, ANTIKOERPER BZW
KONJUGATE ITJR
IMMUNOLTXISCHE NACHWEISE.25
2 4 GLUCURONIDASE.26
2.4.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN
.26
2.4.2 PROTEINREINIGUNG
.
27
2 4.2.1 ANZUCHT UND ZELL-EMTC.27
2.4 2.2 ZELL-AUFSCHLUSS.27
2.4.2.3 AFTINILAETSCHROMATOGRAPHIC.27
2.4.3 PROTEINANALYTIK
.2S
2.4.3.1 GLUCURONIDASC-AKTIVITAET (NACH JCFTCRSON, 1986).28
2.4.3 2 SDS-PAGE.28
2.4 3.3 IMMUNOLOGISCHE NACHWEISVERFAHRCN (WCSTCM-BLOT, DOT-BLOT,
KOLONIC-SSLOT).29
2 4.3.4 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION.30
3 ERGEBNISSE
31
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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I NHALTSVERZEICHNIS
3 1 PHYSIKAIJSCH-TECHNISCHH ENTWICKLUNG DES
IPHT-SYSTI-MS.31
I.
I. 1 PUMPE.32
3.1.2 MESSZELLE.33
3.1.3 SCHLAUCHSYSTEM UND ANSCHLUESSE
.35
3.1.4 DISPERSION
- OPTIMIERUNG DES PROBENAUFIRAGS.35
3.1.5 APPARATIVE EINSCHRAENKUNGEN DES IPHT-SYSTEMS
.3H
3 2 EVALUIERUNG DES IPHT-SYSTKMS.40
3.2.1 PHYSIKALISCHE GROSSEN
.40
3 2 11 SIGNAL VERGLEICH ZWISCHEN IPHT-SVSTEM UND BIACORC 2000.40
3.2 1.2 VERSUCH ZUR NACHWCISGRENZC: BELADUNG EINES NTA-CHIPS MIT NI2-.41
3.2.2 BIOLOGISCHE APPLIKATIONEN ZUR EVALUIERUNG DES IPHT-SYSTEMS
.43
3.2.2.1 IMMUNOLOGISCHER SPR-NACHWEIS VON MYOGLOBIN.43
3.2.2.2 STAPHYLOKINASC.46
3 2.2 3 CHARAKTERISIERUNG DES PROBENAUFTRAGS - NACHWEIS VON
STAPHYLOKINASC IN EINEM DIREKTEN IMMUNOASSAY.47
3 2 2 4 KONZCNTRATIONSBCSTIMMUNG VON STAPHY LOKINASC IN EINEM
KOMPETITIVEN IMMUNOASSAY.53
3.3 WEITERE:
CJFNISNRN-: APPLIKATH INEN.60
3.3.1 DETEKTION VON BAKTERIEN
.60
3.3.1.1 NACHWEIS VON E. COLI K12.61
3.3.1 2 NACHWEIS VON ,STAPHYLOCOCCUS CPIDCRMIDIS' MIT IMMOBILISIERTEM
LEKTIN. .62
3.3.2 EXPERIMENTE ZUM NACHWEIS SPEZIFISCHER EJULOPROTEASEN
.64
3 3 2.1 BEDEUTUNG VON PROTEASEN UND IHRES NACHWEISES. 64
3 3.2.2 ENTWICKLUNG EINES AKTIVITALSASSAYS.65
3 3 2 3 EIN GLUCURONIDASE-FUSIONSPROTEIN (GIJS) ALS MODELL PUR EIN
GROSSES PROTCINSUBSTRAT 66
3.3.2,4 DAS IGASC-PCPTID: EIN PEPTID FUER DEN SPR-NACHWEIS VON
IGA-PROTCASC.67
3 3.2.5 DIE PROTEASE-HELIX: STRUKTUR UND FUNKTION EINES OPTIMIERTEN UND
UNIVERSELLEN PROTEASE-SUBSTRATES 6X
3.3.2 6 EXPERIMENTE MIT DEM IGASC-PCPTID.70
3 3.2.7 EXPERIMENTE MIT PROTCASC-HCLIX.72
4 DISKUSSION.80
5 ZUSAMMENFASSUNG.95
6 ANHANG_ 98
6.1 PCR-PROGRAMM ZT IR KL. )N IHR UNO.98
6
2 PCR-PRIMHR ZUR KLONIERUNG DHR GI.UCURONIDASE:.98
6.3 PCR-PROGRAMM ZUR SEQUENZIERUNG.
99
6.4 SEQI IHNZIHRPRIMKR.
99
6.5 AMINOSAEURHSHQUHNZHN DER PROIEASE-HEUCES.
99
6 6
PUMPE:NPR(X;RAMMEUER IPHT-SYSTHM.100
7 LITERATURVERZEICHNIS.
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