Elektroporation von Säugerzellen: technische Entwicklungen und Applikationen
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1. EINLEITUNG.
2. THEORETISCHE GRUNDLAGEN UND STAND DER TECHNIK
2.1.
GENTECHNISCHE MANIPULATION DES GENOMS
.5
.5
ZL.L. VIRALE GENTRANRFER-SYSTEME.
.5
Z1.2. NICHTVIRALE GENTRANSFER-SYSTEME.J
2.2. ELEKTROPORATION
ZZ1. THEORIE
.6
2.Z2. APPLIKATION UND ENTWICKLUNG
.9
2.3. DIELEKTROPHORESE.
3.
MATERIAL UND METHODEN_
.
11
. 15
3.1. ZELLEN
3.2. GERAETE UND MEDIEN_.16
3.3. ELEKTRODENMATERIALIEN._. 20
3.4. BESTIMMUNG DER ALUMINIUM-KONZENTRATION
_._.20
3.5. AMPLIFIKATION UND ISOLATION DES PLASMIDS
PEGFP ._._21
3.6. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
22
3.7. ELEKTROTRANSFEKTION_._.24
3.7.1. VORBEREITUNG DER ZELLEN.
.24
3.7.2. DURCHFUEHRUNG DER ELEKTROPORATION
.25
3.8. SYNCHRONISATION DER ZELLKULTUREN.25
3.9. DURCHFLUSSZYTOMETRIE.26
3.10. BESTIMMUNG DES ZELLZYKLUSES.28
3.11. AUSWERTUNG.29
3.11.1. BERECHNUNG DPR TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ.29
3.11.2. SIGNIFIKANZTEST
.
30
3.12.
KUENSTLICHE CHROMOSOMEN (MACS). 30
3.1 ZI. ISOLIERUNG UND LAGERUNG DER CHROMOSOMEN.30
3.1Z2. SORTIEREN VON KUENSTLICHEN CHROMOSOMEN
.
5
/
3.1Z3. TRANSFER VON CHROMOSOMEN IN ZELLEN
.32
3.12.4. NACHWEIS DES GENTRANSFERS DURCH KUENSTLICHE CHROMOSOMEN.34
3.13.
ZELLKONZENTRIERUNG IN SUSPENSION_._.35
3.13.1. NEGATIVE DIELEKTROPHORESE IN LEITENDEN MEISSEN.35
3.13.2. KONZENTRIERUNG VON ZELLEN IN LEITENDEM MEDIUM
.35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4. ERGEBNISSE,
37
4.1. VERGLEICH VON
ELEKTRODEN-MATERIAUEN.^.~~.~.~~.~.~~.~.~~.--~~
37
4.2. TRANSFEKTION VON ZELLLINIEN MIT PEGFP----- 38
4.11. BESTIMMUNG DES OPTIMALEN PARAMETERBEREICKES.
.38
4.12. ELEKTROTRANSFEKTION VON ZELLEN AUS PERMANENTEN LINIEN
.40
4.13. EINFLUSS DER PTASNUEDKOMENTRATION AUF DIE TRANSFEKTIONSEFFLZIENZ
.49
4.14. KULTUR VON L929 UNTER SERUMENTZUG NACH DER TRANSFEKTION
.SO
4.3. BESTIMMUNG DER ALUMINIUM-KONZENTRATIONEN -.S1
4.4. EINFLUSS DER LEITFAEHIGKEIT AUF DIE TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 53
4.5. ELEKTROTRANSFEKTION VON PRIMAEREN ZELLEN MIT PEGFP
.-. 56
4.5.1. ELEKTROTRANSFEKTION VON CFB (CARDIOFIBROBLASTEN)
.56
4.5.2. ELEKTROTRANSFEKTION VON EMBRYONALEN STANONZELLEN (ES)
.61
4.6. ELEKTROTRANSFEKTION UND
ZELLZYKLUS.-.-.-67
4.6.1. PRIMAERE FIBROBLASTEN (CFB)
. 67
4.6.2. PRIMAERE STAMMZELLEN
. 74
4.6.3. L929
. 75
4.7. GENTRANSFER DURCH KUENSTLICHE CHROMOSOMEN (MACS).76
4.7.1. TRANSFER VON CHROMOSOMALER DNA IN L929-ZELLEN
.76
4.7.2. SORTIEREN VON KUENSTLICHEN CHROMOSOMAL (MACS)
.79
4.7.3. NACHWEIS DES GENTRANFERS DURCH KUENSTLICHE CHROMOSOMEN
.80
4.8. ZELLKONZENTRIERUNG IN SUSPENSION.81
4.8.1.OPTIMIERUNG DA ELEKTRISCHEN PARAMETER
.81
4.8.2. ENTWICKLUNG EINER ABSAUGKONSTRUKTION ZUR ZELLKONZENTRATION
.84
4.8.3. EINFLUSS DER TEILCHENDICHTE AUF DIE EFFIZIENZ DA AUFLRENNUNG
.89
4.8.4. EINFLUSS DA AUFTRENNUNG AUF DIE VITALITAET DA ZELLEN.
.92
\
4.8.5. EINFLUSS DES ELEKTRISCHEN FELDES
.92
4.8.6. AUFLRENNUNG VON ZELLEN UND MEDIUM
.93
5. DISKUSSION_ 95
5.1. MANIPULATION DES GENOMS MIT HILFE DER ELEKTROPORATION.95
5.2. EINFLUSS DES PORATIONSMEDIUMS AUF DIE ELEKTROTRANSFEKTION.111
5.3. ABTRENNUNG VON FLUESSIGKEITEN AUS EINER ZELLSUSPENSION. 113
5.4. KONZEPT EINES NEUEN ELEKTROPORATIONSGERAETES FUER KLEINE
ZELLZAHLEN_. 115
6. ZUSAMMENFASSUNG_117
7. SUMMARY_119
. 121
8. LITERATUR |
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