Der Experimentator: Molekularbiologie:
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| New Title: | Mülhardt, Cornel Der Experimentator: Molekularbiologie, Genomics |
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Heidelberg [u.a.]
Spektrum Akad. Verl.
2000
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Was ist denn Molekularbiologie , bitteschön? 1
1.1 Das Substrat der Molekularbiologie, oder: Molli World für Anfänger 2
1.2 Was brauche ich zum Arbeiten? 7
1.3 Sicherheit im Labor 8
2 Einige grundlegenden Methoden 11
2.1 Nucleinsäure ist gleich Nucleinsäure und auch wieder nicht 11
2.2 Vom Fällen und Konzentrieren von Nucleinsäuren 13
2.2.1 Alkohol Fällung 13
2.2.2 Konzentratoren 16
2.2.3 Speed vac 17
2.2.4 Aussalzen 17
2.3 Die Reinigung von Nucleinsäuren 17
2.3.1 Phenol Chloroform Extraktion 18
2.3.2 Fällung mit PEG 19
2.3.3 Proteinbindende Filtermembranen 19
2.3.4 Anionenaustauschersäulen 19
2.3.5 Glasmilch 21
2.3.6 Cäsiumchlorid Dichtegradient 21
2.3.7 Dialyse 22
2.4 Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäurelösungen 23
2.5 Methoden zur DNA Präparation 26
2.5.1 Präparation von Plasmid DNA im kleinen Maßstab 26
2.5.2 Präparation von Plasmid DNA im großen Maßstab 28
2.5.3 Bakterienmedien 31
2.5.4 Präparation von Phagen DNA 32
2.5.5 Präparation einzelsträngiger DNA mittels Helferphagen 36
2.5.6 Präparation von genomischer DNA 36
3 Das Werkzeug 38
3.1 Restriktionsenzyme 38
3.2 Gele 46
3.2.1 Agarosegele 46
3.2.2 DNA Fragmente aus Agarosegelen isolieren 51
3.2.3 Polyacrylamidgele (PA Gele) 54
3.2.4 DNA Fragmente aus PA Gelen isolieren 57
3.2.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) 57
3.2.6 Kapillarelektrophorese 58
3.3 Blotten 59
3.3.1 Southern Blot 59
3.3.2 Northern Blot 62
3.3.3 Dot und Slot Blot 64
4 Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) 67
4.1 Die Standard PCR 67
4.2 Tips zur Verbesserung der PCR 77
4.2.1 Nested PCR 79
4.2.2 Multiplex PCR 80
4.2.3 Amplifikation langer DNA Fragmente 80
4.3 PCR Anwendungen 81
4.3.1 Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion (RT PCR) 81
4.3.2 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) 82
4.3.3 Amplifikation zufälliger Produkte 84
4.3.4 Klassische quantitative PCR 85
4.3.5 Real time Quantitative PCR 88
4.3.6 Inverse PCR 93
4.3.7 Biotin RAGE und Supported PCR 94
4.3.8 Mutagenese mit modifizierten Primern 95
4.3.9 ARMS 95
4.3.10 in situ PCR 96
4.3.11 Cycle Sequencing 97
4.3.12 cDNA Synthese 97
4.3.13 Einzelzell PCR 98
5 RNA 100
5.1 Methoden der RNA Isolierung 101
5.2 Methoden der mRNA Isolierung 103
5.3 Reverse Transkription (cDNA Synthese) 104
5.4 In vitro Transkription (in vitro Synthese von RNA) 106
6 Die Klonierung von DNA Fragmenten 108
6.1 Mit welchen Vektoren klonieren? 116
6.1.1 Plasmide 116
6.1.2 Phagen 119
6.1.3 Cosmide 121
6.1.4 PACs und BACs 121
6.1.5 YACs 122
6.2 Welche Bakterien? 123
6.3 Herstellen kompetenter Zellen und Transformation 124
6.4 Probleme beim Klonieren 129
6.5 Die Lagerung von Klonen 130
7 Wie man DNA aufspürt 132
7.1 Herstellung von Sonden 132
7.1.1 Methoden zur Herstellung markierter Sonden 134
7.2 Hybridisierung 138
7.3 Nachweis der markierten DNA 140
7.3.1 Autoradiographie 140
7.3.2 Nicht radioaktive Nachweismethoden 142
7.4 Screenen von rekombinanten DNA Banken 145
8 DNA Analyse 149
8.1 Sequenzierung 149
8.1.1 Radioaktive Sequenzierung 151
8.1.2 Nicht radioaktive Sequenzierung und automatische Sequenzierer 153
8.1.3 Kurioses zum Thema Sequenzieren: Octamere 155
8.2 Methoden zur Analyse von DNA auf Mutationen 156
8.2.1 Restriktionsfragment Längenpolymorphismus (RFLP) 156
8.2.2 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) 157
8.2.3 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) 158
8.2.4 Temporal Temperature Gradient Electrophoresis (TTGE) 161
8.2.5 Heteroduplexanalyse (HA) 161
8.2.6 ARMS 162
8.2.7 Enzymatische Spaltung von Fehlpaarungen (EMC) 162
8.2.8 Protein Truncation Test (PTT) 164
9 Untersuchung der Funktion von DNA Sequenzen 166
9.1 Untersuchung der Transkription in Geweben 167
9.1.1 Ribonuclease protection assay (RPA) 167
9.1.2 in situ Hybridisierung 168
9.1.3 Chromosomale Lokalisierung eines Gens (FISH) 170
9.1.4 in situ PCR 172
9.1.5 Microarrays 172
9.2 Mutagenese 178
9.3 in vitro Translation 186
9.4 Expressionssysteme 187
9.4.1 Bakterielle Expressionssysteme 187
9.4.2 Baculovirus Expressionssysteme 188
9.4.3 Heterologe Expression in Säugerzellen 190
9.4.4 Weitere Expressionssysteme 191
9.4.5 Transfektionsmethoden 192
9.4.6 Kotransfektion mehrerer Gene 200
9.4.7 Transiente und stabile Transfektionen 200
9.4.8 Reportergene 202
9.5 Transgene Mäuse 208
9.5.1 Methoden des Gentransfers 209
9.6 Regulation der Transgenexpression 215
9.6.1 Das Tet System 215
9.6.2 Das Ecdyson System 216
9.7 Gentherapie 217
10 Der Computer und Du 219
11 Zu guter Letzt 224
12 Anhang 226
12.1 Nützliche Tabellen 226
12.2 Standardlösungen 227
12.3 Glossar 229
13 Wer, was, wo? 233
13.1 Lieferanten / Adressen 233
13.2 Literatur 237
14 Register 239
14.1 Register 239
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