Derepression der Hitzeschockreaktion in transgenen Tabakpflanzen durch konstitutive Expression von Arabidopsis-Hitzeschockfaktor-1-Fusionsproteinen:
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| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
München, Eduard-Spranger-Str. 4
<<S.>> Döhr
2000
|
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
.
3
2.1.
DIE
HITZESCHOCKANTWORT
DER
ZELLE
.
3
2.2.
DIE
HITZESCHOCKPROTEINE
.
5
2.2.1.
HSP100
.
5
2.2.2.
HSP90
.
5
2.2.3.
HSP70
.
6
2.2.4.
HSP60
.
7
2.2.5.
KLEINE
HSP
(SHSP)
.
7
2.2.6.
UBIQUITIN
UND
ANDERE
HITZEINDUZIERTE
PROTEINE.
8
2.3.
DIE
REGULATION
DER
HITZESCHOCKANTWORT
.
9
2.3.1.
DIE
PROMOTOREN
DER
HITZESCHOCKGENE
.
9
2.3.2.
DER
HITZESCHOCKFAKTOR
.
9
2.3.3.
DIE
REGULATION
DES
HSF
BEI
HITZESTRESS
.
14
2.4.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
18
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
19
3.1.
BAKTERIENSTAEMME
.
19
3.1.1.
ESCHERICHIA
COLI-STAEMME
.
19
3.1.2.
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS-STAEMME
.
19
3.2.
PLASMIDE
.
19
3.3.
PFLANZEN
.
21
3.4.
GENSONDEN
.
22
3.5.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
22
3.5.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
22
3.5.2.
TRANSGENITAETSNACHWEIS
.
24
3.6.
MEDIEN
UND
PUFFER
.
24
3.6.1.
MEDIEN
.
25
3.6.1.1.
MEDIEN
ZUR
BAKTERIENANZUCHT
.
25
3.6.I.2.
MEDIEN
ZUR
BAKTERIENTRANSFORMATION
.
25
3.6.I.3.
MEDIEN
ZUR PFLANZENANZUCHT
.
27
3.6.I.4.
MEDIEN
ZUR PFLANZENTRANSFORMATION
.
27
3.6.2.
PUFFER
.
28
3.6.2.1
PUFFER
FUER
NUKLEINSAEUREN
.
28
INHALTSVERZEICHNIS
3.OE.2.2.
PUFFER
FUER
PROTEINE
.
30
3.6.2.3.
ELEKTROPHORESEPUFFER
FUER
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINE
.
31
3.OE.2.4.
ELEKTROPHORESEGELE
FUER
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINE
.
32
3.6.2.5.
BLOTTING
UND
HYBRIDISIERUNGSLOESUNGEN
FUER
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINE
.
33
3.6.2.6.
SONSTIGE
LOESUNGEN
.
35
3.7.
ANTIKOERPER,
ENZYME
UND
KITS
.
36
3.7.1.
ANTIKOERPER
.
36
3.7.2.
ENZYME
.
36
3.7.2.
KITS
.
27
3.8.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
38
3.8.1.
CHEMIKALIEN
.
38
3.8.2.
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
40
3.9.
COMPUTERPROGRAMME
UND
DATENBANKEN
.
40
3.10.
KULTIVIERUNGSMETHODEN
.
41
3.10.1.
KULTIVIERUNG
VON
PFLANZEN
IN
VITRO
.
41
3.10.1.1.
OBERFLAECHENSTERILISATION
VON
SAMEN
.
41
3.10.1.2.
PFLANZENKULTUR
AUF
FESTMEDIUM
.
41
3.10.2.
KULTIVIERUNG
VON
PFLANZEN
IN
SITU
.
41
3.10.3.
HITZESCHOCKBEHANDLUNG
VON
PFLANZENGEWEBE
.
41
3.10.3.1.
HITZESCHOCKBEHANDLUNG
VON
BLATTGEWEBE
.
41
3.10.3.2.
HITZESCHOCKBEHANDLUNG
VON
KEIMLINGEN
.
42
3.10.4.
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
.
42
3.11.
TRANSFORMATIONSMETHODEN
.
43
3.11.1.
TRANSFORMATION
VON
N.
TABACUML
.
43
3.11.2.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
44
3.11.2.1.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
.
44
3.11.2.2.
TRANSFORMATION
VON
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
.
44
3.12.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
45
3.12.1.
AUFREINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
45
3.12.1.1.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
PFLANZENGEWEBE
.
45
3.12.1.2.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
PFLANZENGEWEBE
.
46
3.12.1.3.
GEWINNUNG
VON
MRNA
AUS
GESAMT-RNA
.
47
3.12.1.4.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COZI-ZELLEN
.
47
INHALTSVERZEICHNIS
3.12.1.5.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
ZELLEN
.
47
3.12.2.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
.
48
3.12.2.1.
PHENOLEXTRAKTION
.
48
3.12.2.2.
ALKOHOLFAELLUNG.
48
3.12.2.3.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
49
3.12.2.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
49
3.12.2.5.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
.
50
3.12.3.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
50
3.12.3.1.
VERDAUUNG
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
50
3.12.3.2. DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
50
3.12.3.3. LIGATION
VON
DNA
.
51
3.12.3.4. AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
(PCR)
.
51
3.12.4.
DNA-SEQUENZIERUNG
MIT
DEM
A.L.F
.
53
3.12.5.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
53
3.12.5.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
UEBER
RANDOM
PRIMING
.
53
3.12.5.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
RNA
UEBER
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
.
54
3.12.6.
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
VON
RNA
.
55
3.12.6.1.
NORTHERN
BLOT
.
55
3.12.6.2.
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
VON
RNA
.
55
3.12.6.3.
FAERBUNG
VON
RNA
AUF
NORTHERN
BLOTS
.
56
3.13.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
56
3.13.1.
PROTEINMENGENBESTIMMUNG
.
56
3.13.2.
GUS-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
56
3.13.3.
GUS-DETEKTION
IM
AKTIVITAETSGEL
.
57
3.13.4. IMMUNODETEKTION
VON
PROTEINEN
.
58
3.13.4.1.
EXTRAKTION
VON
PROTEINEN
AUS
PFLANZENMATERIAL
.
58
3.13.4.2.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
UND
IMMUNOBLOTTING
.
59
3.13.4.3.
IMMUNODETEKTION
.
59
3.14.
ABKUERZUNGEN
.
61
4.
ERGEBNISSE
.
65
4.1.
ERZEUGUNG
VON
TRANSGENEN
TABAKPFLANZEN
.
65
4.1.1.
KONSTRUKTION
DER
VEKTOREN
PBINL9-HG
UND
PBINL9-HGAL
BIS
HGA4.
66
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.2.
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PHTX-HN
.
69
4.1.3.
TRANSFORMATION
WN
NICOTIANA
TABACUM
L.
CV.
SRI
.
71
4.1.4.
NACHWEIS
DER
TRANSGENITAET
UEBER
PCR
.
72
4.1.5.
NORTHERN
BZOT-ANALYSE
DER
TRANSGENEN
TABAKPFLANZEN
.
73
4.2.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
FUSIONSPROTEINE
VON
HSF
MIT
GUS
UND
GUS
DELETIONEN
IN
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
76
4.2.1.
FUNKTIONALITAET
DES
GUS-ENZYMS
IN
DEN
FUSIONSPROTEINEN
.
76
4.2.1.1.
GUS-ASSAY
.
76
4.2.I.2.
GUS-AKTIVITAETSGEL
.
79
4.2.2.
UNTERSUCHUNG
DER
FUNKTIONALITAET
DES
HSF-ANTEILS
IN
FUSIONEN
MIT
GUS
BZW.
GUS-DELETIONEN.
81
4.3.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
HSF-NPTII
FUSIONSPROTEINE
IN
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
83
4.3.1.
FUNKTIONALITAET
DES
ENZYMS
NPTII
IN
DEN
HSF-NPTII
FUSIONSPROTEINEN.
83
4.3.2.
NACHWEIS
DES
FUSIONSPROTEINS
HSF-NPTII
IM
WESTERN
BLOT
.
84
4.3.3.
UNTERSUCHUNG
DER
FUNKTIONALITAET
DES
HSF
IN
FUSIONSPROTEINEN
MIT
NPTII
.
85
4.4.
THERMOTOLERANZTEST
VON
TL-PFLANZEN
MIT
DEN
KONSTRUKTEN
HG,
AL
BIS
A4
UND
HN
.
87
5.
DISKUSSION
.
89
5.1.
DIE
FUNKTIONALITAET
VON
GUS
UND
NPTII
IN
HSF-FUSIONSPROTEINEN
.
89
5.2.
DIE
AKTIVITAET
VON
HSF
ALS
FUSIONSPROTEIN
.
91
5.3.
UEBERLEGUNGEN
ZU
MOEGLICHEN
MECHANISMEN
BEI
DER
HSF-DEREGULATION
.
92
5.4.
ANWENDUNGSASPEKTE
.
95
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
97 |
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