Hepatitis-B-Virus-Infektionen: die Rolle der Virushülle in der Morphogenese, Pathogenese und Prophylaxe
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1. EINLEITUNG 1
1.1 DAS HEPATITIS-B-VIRUS (HBV) 1
1.2 GENETISCHE ORGANISATION VON HBV 2
1.3 DIE PROTEINE VON HBV 5
1.4 INFEKTIONSZYKLUS VON HBV 10
1.5 PATHOGENESE VON HBV 13
1.6 PROPHYLAXE, DIAGNOSE UND THERAPIE VON HBV-INFEKTIONEN 16
1.7 PROBLEMSTELLUNG 18
2 . MATERIAL UND METHODEN 20
2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 20
2.2 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 20
2.2.1 DARSTELLUNG VON PROTEINEN DURCH SDS-PAGE, WESTERN- UND
IMMUNOBLOT 20
2.2.2 ANREICHERUNG UND QUANTIFIZIERUNG VON PROTEINEN 21
2.2.3 DARSTELLUNG VON PROTEINEN DURCH CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTEN
ZENTRIFUGATION 21
2.2.4 DARSTELLUNG VON PROTEINEN DURCH SACCHAROSE-SEDIMENTATIONS
ZENTRIFUGATION 21
2.3 ZELLBIOLOGISCHE ARBEITEN 22
2.3.1 EXPRESSION VON PROTEINEN IN SAEUGERZELLEN 22
2.3.2 TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN 22
2.3.3 RADIOMARKIERUNG VON SAEUGERZELLEN UND IMMUNPRAEZIPITATION 23
2.3.3.1 RADIOMARKIERUNG 23
2.3.3.2 ZELLYSE MIT RIPA-PUFFER 24
2.3.3.3 IMMUNPRAEZIPITATION 24
2.3.4 ALTERNATIVE ZELLAUFSCHLUSS-METHODEN 25
2.3.4.1 ZELLYSE MIT CHAPS-PUFFER 25
2.3.4.2 ZELLYSE MIT NP-40-PUFFER 25
2.3.4.3 ZELLYSE DURCH HOMOGENISATION 26
2.3.5 PROTEASESCHUTZVERSUCHE 26
2.3.6 ENZYMATISCHE DEGLYKOSYLIERUNGEN VON PROTEINEN 27
2.3.6.1 ENDOGLYKOSIDASE H (ENDOH) 27
2.3.6.2 PEPTID:N-GLYKOSIDASE F (PNGASEF) 27
2.3.6.3 O-GLYKOSIDASE 28
2.3.7 EXPRESSION VON PROTEINEN IM ZELLFREIEN SYSTEM 28
2.3.7.1
IN VTI/-0-TRANSKRIPTION/TRANSLATION/TRANSLOKATION 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.3.7.2 NATRIUMCARBONAT-EXTRAKTION 28
2.3.7.3 KOIMMUNPRAEZIPITATION 29
2.3.8 EXPRESSION VON PROTEINEN IN
E.COLI 29
2.3.8.1 EXPRESSION UND REINGUNG VON FUSIONSPIOTEINEN 29
2.3.8.2 UNTERSUCHUNGEN ZU PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN 30
2.4 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 30
2.4.1 TIERMODELLE 30
2.4.2 NACHWEIS VON ANTIGENEN DURCH ELISA 30
2.4.2.1 HBSAG-ELISA 30
2.4.2.2 PRAES-ELISA 31
2.4.3 IMMUNISIERUNG VON VERSUCHSTIEREN 31
2.4.3.1 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN MIT PROTEINEN 31
2.4.3.2 IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN MIT PROTEINEN 32
2.4.3.3 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN MIT PLASMID-DNA 32
2.4.3.4 GEWINNUNG UND AUFARBEITUNG DER SEREN 32
2.4.4 NACHWEIS VON ANTIKOERPERN DURCH ELISA 32
2.4.4.1 ANTI-HBS-ELISA 32
2.4.4.2 ANTI-PRAES-ELISA 33
3. ERGEBNISSE 34
3.1 DIE DREI HUELLPROTEINE VON HBV: ETABLIERUNG VON EXPRESSIONSSYSTEMEN
ZUR CHARAKTERISIERUNG DER PROTEINE 34
3.2 DIE ROLLE DES GROSSEN L-HUELLPROTEINS IM LEBENSZYKLUS VON HBV 36
3.2.1 MYRISTYLIERUNG UND INTRAZELLULAERE RETENTION VON L 36
3.2.2 TOPOLOGIE UND TRANSLOKATION VON L 40
3.2.2.1 DUALE TOPOLOGIE VON L 41
3.2.2.2 POSTTRANSLATIONALE TRANSLOKATION VON L 43
3.2.2.3 DUALE TOPOLOGIE UND RETENTION VON L 44
3.2.2.4 DUALE TOPOLOGIE UND SEKRETION VON L 45
3.2.3 REGULATION DER TRANSLOKATION UND TOPOLOGIE VON L 46
3.2.3.1 IDENTIFIZIERUNG EINER ZYTOSOLISCHEN VERANKERUNGSDETERMINANTE
(CAD) 46
3.2.3.2 KARTIERUNG VON CAD 47
3.2.3.3 CHARAKTERISIERUNG VON CAD 48
3.2.3.4 HSC70 ALS SPEZIFISCHER INTERAKTIONSPARTNER DER CAD-SEQUENZ
VON L
49
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.3 DIE ROLLE DES MITTLEREN M-HUELLPROTEINS IM LEBENSZYKLUS VON HBV 53
3.3.1 N-GLYKOSYLIERUNG UND SEKRETION VON M 53
3.3.2 CALNEXIN ALS SPEZIFISCHER INTERAKTIONSPARTNER VON M 55
3.3.3 O-GLYKOSYLIERUNG UND SEKRETION VON M 57
3.3.4 GLYKOSYLIERUNG UND INTRAZELLULAERE LOKALISATION VON M 58
3.4 DIE ROLLE DES KLEINEN S-HUELLPROTEINS IM LEBENSZYKLUS VON HBV 60
3.4.1 BILDUNG UND SEKRETION LEERER VIRUSHUELLEN 60
3.4.1.1 KONSTRUKTION VON S-DELETIONSMUTANTEN 61
3.4.1.2 SEKRETION VON S-DELETIONSMUTANTEN 63
3.4.1.3 CHARAKTERISIERUNG SEKRETIONSKOMPETENTER S-DELETIONSMUTANTEN 63
3.4.1.4 CHARAKTERISIERUNG SEKRETIONSDEFEKTER S-DELETIONSMUTANTEN 64
3.4.2 TOPOLOGIE UND BILDUNG LEERER VIRUSHUELLEN 65
3.5 HBV-VAKZINE 68
3.5.1 PROTEIN-VAKZINE 68
3.5.1.1 KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG MODIFIZIERTER SUBVIRALER
PARTIKEL 68
3.5.1.2 ANTIGENITAET UND IMMUNOGENITAET MODIFIZIERTER SUBVIRALER
PARTIKEL 72
3.5.2 DNA-VAKZINE 73
3.5.2.1 KONSTRUKTION UND IMMUNOGENITAET VON DNA-VAKZINEN 74
4. DISKUSSION 76
4.1 DAS GROSSE L-HUELLPROTEIN VON HBV: STRUKTUR, FUNKTION UND
MECHANISMUS 76
4.2 DAS MITTLERE M-HUELLPROTEIN VON HBV: STRUKTUR, FUNKTION UND
MECHANISMUS 86
4.3 DAS KLEINE S-HUELLPROTEIN VON HBV: STRUKTUR, FUNKTION UND
MECHANISMUS 90
4.4 ENTWICKLUNG PRAESL-HALTIGER HBV-VAKZINE 94
5. ZUSAMMENFASSUNG 98
6. LITERATURVERZEICHNIS 100 |
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