Null-Mutanten in der Funktionsanalyse von Myelin-spezifischen Proteinen:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
MYELIN
UND
MYELINISIERUNG
.
1
1.2
ZUSAMMENSETZUNG
DES
MYELINS
.
2
1.2.1
LIPIDE
.
4
1.2.2
PROTEINE
.
.4
1.2.2.1
PROTEOLIPIDPROTEIN
(PLP)
.
6
1.2.2.2
BASISCHE
MYELINPROTEINE
(MBP)
.
10
1.2.2.3
MYELIN-ASSOZIIERTES
GLYKOPROTEIN
(MAG)
.
11
1.2.2.4
OLIGODENDROZYTEN/MYELIN
ASSOZIIERTES
GLYKOPROTEIN
(OMGP)
.
12
1.3
ERSTELLUNG
TRANSGENER
TIERMODELLE
DURCH
GENE
TARGETING
.
13
2
AUFGABENSTELLUNG
.
15
3
ERGEBNISSE
.
16
3.1
GENERIERUNG
UND
ANALYSE
DER
MAG-/-,PLP-/
DOPPELMUTANTE
UND
EINER
MAG-/-,
PLP-/-,
MBP-/
TRIPELMUTANTE
.
16
3.1.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ANALYSE
.
16
3.1.1.1
KONSTRUKTE
UND
GENOTYPISIERUNG
.
16
3.1.1.2
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
.
20
3.1.1.3
RNA-ANALYSE
.
21
3.1.2
PROTEINCHEMISCHE
ANALYSE
.
25
3.1.2.1
IMMUNHISTOCHEMIE
.
27
3.1.2.2
LIPIDANALYSE
.
28
3.1.3
MORPHOLOGIE
.
31
3.1.4
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
35
3.1.5
VERHALTENSTESTS
.
36
3.1.5.1
MORRIS
WATER
MAZE
TEST
.
36
3.1.5.2
OPENFIELD
TEST
.
37
3.1.5.3
ROTA-ROD
TEST
.
39
3.1.5.4
DESCENDING
A
VERTICAL
POLE
TEST
.
39
3.1.5.5
HORIZONTAL
WIRE
/
HORIZONTAL
BRIDGE
TEST
.
40
3.1.5.6
INCLINED
GRID
TEST
.
41
3.1.6
KRYOKONSERVIERUNG
VON
EMBRYONEN
.
42
3.2
GENERIERUNG
EINER
OMGP-DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
OLIGODENDROZYTEN/MYELIN
ASSOZIIERTEN
GLYKOPROTEIN
(OMGP)
.
43
3.2.1
GENERIERUNG
EINER
OMGP-DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
.
43
3.2.1.1
ISOLIERUNG
DER
GENOMISCHEN
OMGP-DNA
.
.43
3.2.1.2
KLONIERUNGSSTRATEGIE
.
44
3.2.1.3
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
ES-ZELL
KLONE
.
46
3.2.1.4
EMBRYONENMANIPULATION
.
47
3.2.1.5
SOUTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNGSANALYSE
DER
TRANSGENEN
MAUSLINIE
.
48
3.2.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EMBRYOGENESE
.
50
3.2.2.1
MORPHOLOGIE
.
50
3.2.2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ANALYSE
.
51
3.2.2.3
PROTEINCHEMISCHE
ANALYSE
.
54
3.2.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
OLIGODENDROZYTEN/MYELIN
ASSOZIIERTEN
GLYKOPROTEIN
(OMGP)
AN
ADULTEM
GEWEBE
.
56
3.2.3.1
RNA-ANALYSE
.
56
3.2.3.2
IMMUNHISTOCHEMIE
.
59
4
ZUSAMMENFASSUNG
.
61
5
DISKUSSION
.
64
5.1.1
MYELINISIERUNG
IN
PLP-/-,
MBP-/-,
MAG-/
EINZEL-,
DOPPEL
UND
TRIPEL-MUTANTEN
.
64
5.1.2
GENERIERUNG
UND
ANALYSE
EINER
OMGP-DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
.
68
6
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
71
6.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
.
71
6.1.1
DNA-PRAEPARATION
.
71
6.1.1.1
PHAGEN-DNA-PRAEPARATION
.
71
6.1.1.2
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
ES-ZELLEN
.
71
6.1.1.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
SCHWANZSPITZEN-BIOPSIEN
.
72
6.1.1.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
72
6.1.1.5
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
72
6.1.1.6
SOUTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
.
72
6.1.1.7
DNA-SEQUENZIERUNG
.
72
6.1.1.8
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
73
6.1.2
RNA-PRAEPARATION
.
73
6.1.2.1
NORTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
.
73
6.1.2.2
RT-PCR
.
74
6.
1
.2.3
QUANTITATIVE
RT-PCR
.
74
6.2
PROTEINCHEMISCHE,
IMMUNOLOGISCHE
UND
HISTOLOGISCHE
METHODEN
.
74
6.2.1.1
MYELINPRAEPARATION
.
74
6.2.1.2
EXPRESSION
DES
REKOMBINANTEN
OMGP
PROTEINFRAGMENTES
IN
E.
COLI
.
75
6.2.1.3
GEWINNUNG
VON
ANTISERUM
.
75
6.2.1.4
REINIGUNG
DES
ANTI-OMGP-ANTIKOERPERS
.
76
6.2.1.5
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
76
6.3
LIPIDANALYSE
.
76
6.4
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
77
6.5
ELEKTROMYOGRAPHIE
.
77
6.6
METHODEN
ZUM
GENE-TARGETING
.
77
6.6.1.1
KULTUR
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
(ES-ZELLEN)
DER
MAUS
.
77
6.6.1.2
ELEKTROPORATION
UND
SELEKTION
VON
ES-ZELLEN
.
78
6.6.1.3
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
.
78
6.6.1.4
KARYOTYPENBESTIMMUNG
EMBRYONALER
STAMMZELLEN
.
78
6.6.1.5
MAEUSEZUCHT
UND
HALTUNG
.
79
6.6.1.6
EMBRYONENSPENDER
.
79
6.6.1.7
GEWINNUNG,
INJEKTION
UND
REIMPLANTATION
VON
BLASTOZYSTEN
.
79
6.6.1.8
AGGREGATION
VON
ES-ZELLEN
MIT
EMBRYONEN
IM
8-ZELLSTADIUM
.
80
6.6.1.9
KRYOKONSERVIERUNG
VON
EMBRYONEN
.
80
6.7
VERHALTENSUNTERSUCHUNGEN
AN
DEN
MAUSMUTANTEN.
80
6.7.1.1
MORRIS
WATER
MAZE
TEST
.
81
6.7.1.2
OPENFIELD
TEST
.
81
6.7.1.3
ROTA-ROD
TEST
.
81
6.7.1.4
DESCENDING
VERTICAL
POLE
TEST
.
82
6.7.1.5
HORIZONTAL
WIRETEST
.
82
6.7.1.6
HORIZONTAL
BRIDGETEST
.
82
6.7.1.7
INCLINED
GRID
TEST
.
82
6.7.
1
.8
FUSSABDRUCKMUSTER
.
82
7
ANHANG
.
83
8
LITERATUR
.
89 |
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