Plastidäre Phosphat-Translokatoren: Analyse transgener Pflanzen und gewebespezifische Lokalisation in C3- und C4-Pflanzen
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
I
1.1.
DER
TRIOSEPHOSPHAT/PHOSPHAT-TRANSLOKATOR
.
5
1.2.
DER
GLUKOSE
6-PHOSPHAT/PHOSPHAT-TRANSLOKATOR
.
6
1.3.
DER
PHOSPHOENOLPYRUVAT/PHOSPHAT-TRANSLOKATOR
.
9
1.4.
CUEL-ARABIDOPSIS
MUTANTEN
.
10
1.5.
ZIELSETZUNG
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
.12
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1,
MATERIAL
.
13
2.1.1.
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.13
2.1.2.
PFLANZENMATERIAL
.
13
2.1.3.
BAKTERIENSTAEMME
UND
VEKTOREN
.
.
13
2.2.
METHODEN
.14
2.2.1.
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
.14
2.2.2.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
UND
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
15
2.2.3.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
UND
ELEKTROTRANSFBRMATION
VON
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
.
16
2.2.4.
PFLANZENTRANSFORMATION
.
17
2.2.5.
ISOLIERUNG
VON
PFLANZEN-DNA
.
18
2.2.6.
ISOLIERUNG
VON
PFLANZEN-RNA
.
.
20
2.2.7.
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
IN
AGAROSEGELEN
.
21
2.2.8.
TRANSFER
VON
NUCLEINSAEUREN
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
(YYSOUTHERN
"
-
BZW.
,,NORTHEM
"
-BLOT)
.
22
2.2.8.1.
SOUTHERN-BLOT
.
22
2.2.8.2.
NORTHERN-BLOT
.
23
2.2.9.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
23
2.2.10.
HYBRIDISIERUNG
VON
NYLONMEMBRANEN
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
.
23
2.2.11.
"RNASE-PROTECTION-ASSAY
(RPA)
.
24
2.2.12.
IN
SIRA-HYBRIDISIERUNG
.
26
2.2.12.1.
GEWEBEFIXIERUNG
UND
EINBETTUNG
DES
PFLANZENMATERIALS
.
26
2.2.12.2.OBJEKTTRAEGER
UND
GEWEBESCHNITTE
.
27
2.2.L2.3.LN
VITRO-TRANSKRIPTION
ZUR
HERSTELLUNG
VON
RIBOSONDEN
.
27
2.2.12.4.LAENGENBESTIMMUNG
DER
RIBOSONDEN
.
29
2.2.12.5.
HYBRIDISIERUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
MIT
RADIOAKTIVEN
RIBOSONDEN
.
30
2.2.12.6.HYBRIDISIERUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
MIT
DIG-UTP
MARKIERTEN
RIBOSONDEN
.
32
2.2.12.7.NACHWEIS
DER
RADIOAKTIVEN
HYBRIDISIERUNGSSTELLEN
.
34
2.2.12.8.NACHWEIS
DIG-MARKIERTER
HYBRIDISIERUNGSSTELLEN
.
34
2.2.13.
PROTEIN-BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
36
2.2.13.1.SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHOTESE
(SDS-PAGE)
VON
PROTEINEN
.
36
2.2.13.2.
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
COOMASSIE-BRILLIANTBLAU
.
38
2.2.13.3.
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
SILBERNITRAT
.
38
2.2.1
3.4.ELEKTRO-TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
(WESTERN-BLOT)
.
39
2.2.13.5.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
IMMOBILISIERTEN
PROTEINEN
.
40
2.2.13.6.REINIGUNG
EXPRIMIERTER
PMAL-C2
FUSIONSPROTEINE
DURCH
AMYLOSE-AFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE
.
42
2.2.13.7.
AUFARBEITUNG
VON
E.
COLI
GESAMTPROTEIN
.
43
2.2.13.8.GESAMTPROTEIN-EXTRAKTION
AUS
MAISBLAETTEM
.
43
2.2.14.
IMMUNLOKALISATION
.
44
2.2.14.1.
PEPTIDSPEZIFISCHE
ANTIKOERPER
.
44
2.2.
14.2.PEPTID-ELISA
(ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY)
.
45
2.2.14.3.IMMUNLOKALISATION
IN
MAISBLATT
GEWEBE
.
46
2.2.15.
KOHLENSTOFFVERTEILUNG
IN
PFLANZENGEWEBE
.
47
2.2.15.1.
14
C-MARKIERUNGSEXPERIMENTE
.
47
2.2.15.2.AUFARBEITUNG
DER
IN
ETHANOL
UNLOESLICHEN
FRAKTION
.
48
2.2.15.3.
AUFARBEITUNG
DER
IN
ETHANOL
LOESLICHEN
FRAKTION
.
48
2.2.15.4.
AUFTRENNUNG
DER
IN
ETHANOL
LOESLICHEN
FRAKTION
IN
NEUTRALE,
SAURE
UND
BASISCHE
KOMPONENTEN.
.
49
2.2.16.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
49
2.2.16.1
.MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARD-METHODEN
.
50
3.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
51
3.1.
PFLANZENTRANSTBRMATIONEN
.
51
3.1.1.
UEBEREXPRESSION
DES
PHOSPHOENOLPYRUVAT/PHOSPHAT-TRANSLOKATORS
AUS
BLUMENKOHL
IN
TRANSGENEM
TABAK
.
53
3.1.2.
ANTISENSE
EXPRESSION
DES
PHOSPHOENOLPYRUVAT/PHOSPHAT-TRANSLOKATORS
IN
TABAKPFLANZEN.
54
3.1.2.1.
GENOMISCHE
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
.
55
3.1.2.2.
RNA
EXPRESSIONS-ANALYSE
DERATOPPT-PFLANZEN
.
57
3.1.3.
L4
C-MARKIERUNGSEXPERIMENTE
MIT
TABAKPFLANZEN
.
62
3.2.
MRNA-EXPRESSIONSANALYSEN
CHLOROPLASTIDAERER
PHOSPHAT-TRANSLOKATOREN
IN
MAIS
UND
BLUMENKOHL.
.
67
3.2.1.
DIE
GEWEBESPEZIFISCHE
EXPRESSION
CHLOROPLASTIDAERER
PHOSPHAT-TRANSLOKATOREN
.
67
3.2.2.
GEWEBEERHALTUNG
DES
PROBENMATERIALS
.
69
3.2.3.
MERKMALE
DER
VERWENDETEN
VOLLAENGEN-RIBOSONDEN
FUER
IN
.VZTA-HYBRIDISIERUNGEN
.
70
3.2.4.
BUENDELSCHEIDENZELLEN
UND
MESOPHYLLZELLEN
SPEZIFISCHE
MRNA-EXPRESSION
IN
MAISBLAETTEM
.
.
72
3.2.5.
MRNA
EXPRESSION
CHLOROPLASTIDAERER
PHOSPHAT-TRANSLOKATOREN
IN
MAIS
.
73
3.2.5.1.
TPTMB2
MRNA-EXPRESSION
IN
MAISBLAETTEM
.
73
3.2.5.2.
MZRPPT4
MRNA-EXPRESSION
IN
MAISBLAETTEM
.
75
3.2.5.3.
MZBPPT
MRNA-EXPRESSION
IN
MAISBLAETTEM
.
76
3.2.5.4.
ZMGPT
MRNA-EXPRESSION
IN
MAISKOERNERN
18
TAGE
NACH
DER
BESTAEUBUNG
.
77
3.2.6.
MRNA-EXPRESSION
CHLOROPLASTIDAERER
PHOSPHAT-TRANSFOKATOREN
IN
BLUMENKOHL
.
79
3.2.6.1.
CAULI-TPTL
MRNA-EXPRESSION
IN
BLUMENKOHL
.
79
3.2.6.2.
CAULI-PPT3
MRNA-EXPRESSION
IN
BLUMENKOHL
.
82
3.2.6.3.
CAULI-GPT
MRNA-EXPRESSION
IN
BLUMENKOHL
.
83
3.2.7.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
MRNA-EXPRESSIONSANALYSEN
.
84
3.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEINEXPRESSION
DES
TPT,
PPT
UND
GPT
IN
MAIS
.
88
3.3.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANTI-TPT-PEPTID,
ANTI-PPT-PEPTID
UND
ANTI-GPT-PEPTID
SEREN
DURCH
WESTEM-BFOT-ANALYSEN
.
91
3.3.2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DES
TPTMB2
UND
MZRPPT4
IN
E.TOLI
.
97
3.3.3.
KONSTRUKTION
DER
PLASMIDE
PMAL-TPTPART
UND
PMAL-PPTPART
.
99
3.4.
PROTEINEXPRESSION
CHFOROPLASTIDAERER
PHOSPHAT-TRANSFOKATOREN
IN
GEWEBESCHNITTEN
VON
MAISBLAETTEM.
.
108
3.4.1.
EXPRESSION
DES
PPT
PROTEINS
IN
MAISBLAETTEM
.
109
3.4.2.
EXPRESSION
DES
TPT
PROTEINS
IN
MAISBLAETTEM
.
112
3.4.3.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
PROTEIN
EXPRESSIONSANALYSEN
.
114
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
115
5.
LITERATURVERZEICHNIS
.
116
6.
ABKUERZUNGEN
.
130 |
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