Zur Rolle von Ets-1 bei der Expression von Matrix-Metalloproteinasen in humanen Fibrosarkomzellen:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
.I
ABKUERZUNGEN
.
IV
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
PROTEOLYTISCHER
GEWEBEABBAU
.
1
1.2.
MATRIX-METALLOPROTEINASEN
(MMP)
.
2
1.2.1.
STRUKTUR
DER
MMP
.
4
1.2.2.
REGULATION
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
DER
MMP
.
7
1.2.2.1.
REGULATION
DER
GENEXPRESSION/TRANSKRIPTION
.
8
1.2.2.1.1.
ETS-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
11
1.2.3.
DIE
PHYSIOLOGISCHE
ROLLE
VON
MMP
.
15
1.2.4.
DIE
ROLLE
VON
MMP
IN
PATHOLOGISCHEN
PROZESSEN
.
16
2.
FRAGESTELLUNG.
20
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
21
3.1.
MATERIAL
.
21
3.1.1.
MATERIALIEN
.
21
3.1.2.
SOFTWARE
.
22
3.1.3.
CHEMIKALIEN
.
22
3.1.4.
ANTIKOERPER,
ZYTOKINE,
ENZYME
.
24
3.1.5.
VEKTOREN
.
25
3.1.6.
KITS
.
25
3.1.7.
ZELLEN
.
26
3.2.
METHODEN
.
27
3.2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
27
3.2.1.1.
MEDIEN
.
27
3.2.I.2.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
.
28
3.2.1.3.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
(MAXIPRAEPARATION)
.
28
3.2.I.4.
ISOLIERUNG
GENOMISCHERDNA
.
29
3.2.I.5.
ISOLIERUNG
VON
RNA
.
30
3.2.I.6.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
30
3.2.I.7.
ENZYMATISCHE
VERDAUUNG
VON
DNA
.
30
3.2.1.8.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
31
3.2.I.9.
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
31
3.2.1.10.
ECHTZEIT-PCR
.
32
3.2.1.11.
ZELLKEMEXTRAKT
MINIPRAEPARATION
.
34
INHALTSVERZEICHNIS
N
3.2.1.12.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.35
3.2.1.13.
GEL-RETARDATIONSEXPERIMENTE
.
36
3.2.2.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
38
3.2.2.I.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
38
3.2.2.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
(BCA-TEST)
.
38
3.2.2.3.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
38
3.2.2.4.
WESTERN
BLOT
.
39
3.2.2.5.
GELATINE-ZYMOGRAPHIE
.
40
3.2.2.6.
ELISA
.
42
3.2.2.6.1
MMP-ELISA
.
43
3.2.2.6.2
UPA-ELISA
.
44
3.2.2.6.3
CAT-ELISA
.
45
3.2.2.7.
GELATINASEN-FLUORESZENZTEST
.
45
3.2.2.8.
SEAP-REPORTERGENTEST
.
46
3.2.3.
ZELLKULTUR
.
47
3.2.3.I.
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
47
3.2.3.2.
ISOLIERUNG
HUMANER
RA-SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
47
3.2.3.3.
KULTIVIERUNG,
STIMULATION
UND
ERNTE
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
.
48
3.2.3.4.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
.
49
3.2.3.5.
TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
.
49
3.2.3.5.I.
MODIFIZIERTE
CALCIUM-PHOSPHATKOPRAEZIPITATION
.
50
3.2.3.5.2.
LIPOFECTIN
.
51
3.2.3.5.3.
FUGENE
6
.
51
3.2.3.5.4.
SUPERFECT
.
52
3.2.3.5.5.
SUPERFECT
MIT
MAGNETSAEULENSEPARATION
.
52
4.
ERGEBNISSE
.
54
4.1.
SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
54
4.1.1.
ZELLCHARAKTERISIERUNG
.
55
4.1.2.
EXPRESSION
VON
PROTEASEN
IN
SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
59
4.1.2.1.
MMP-SEKRETION
DER
SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
60
4.I.2.2.
UROKINASE
(UPA)-SEKRETION
DER
SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
62
4.1.3.
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
BEI
DEN
SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
63
4.2.
FIBROSARKOMZELLINIEN
.
65
4.2.1.
ZELLCHARAKTERISIERUNG
.
65
4.2.2.
EXPRESSION
VON
PROTEASEN
IN
FIBROSARKOMZELLEN
.
68
4.2.2.1.
GELATINASE-FLUORESZENZTEST
.
68
4.2.2.2.
HS633.T-ZELLEN
.
71
INHALTSVERZEICHNIS
DI
4.2.2.2.I.
MMP-SEKRETION
DER
HS633.T-ZELLEN
.
71
4.2.2.2.2.
UROKINASE
(UPA)-SEKRETION
DER
HS633.T-ZELLEN
.
75
4.2.2.2.3.
MRNA
U.
PROTEINNACHWEIS
VON
MMP
IN
HS633.T-ZELLEN
.
76
4.2.2.3.
HT-1080-ZELLEN
.
79
4.2.2.3.I.
MMP-SEKRETION
DER
HT-1080-ZELLEN
.
79
4.2.2.3.2.
UROKINASE
(UPA)-SEKRETION
DER
HT-1080-ZELLEN
.
82
4.2.2.3.3.
MRNA
U.
PROTEINNACHWEIS
VON
MMP
IN
HT-1080-ZELLEN
.
83
4.2.3.
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZEN
BEI
DEN
FIBROSARKOMZELLINIEN
.
85
4.3.
ROLLE
VON
ETS-1
BEI
DERMMP-EXPRESSION
.
87
4.3.1.
ETS-1-EXPRESSION
.
87
4.3.1.1.
NACHWEIS
DER
MRNA
VON
ETS-1
.
87
4.3.1.2.
NACHWEIS
DES
PROTEINS
VON
ETS-1
.
88
4.3.2.
ROLLE
VON
ETS-1
BEI
DER
EXPRESSION
VON
PROTEASEN
.
91
4.3.2.I.
PROXIMALES
ETS-MOTIV
UND
MMP
1
-EXPRESSION
.
91
4.3.2.2.
WIRKUNG
DER
BLOCKADE
VON
ETS-1-PROTEIN
AUF
DIE
SEKRETION
DER
PROTEASEN
.
93
4.3.2.3.
BINDUNG
VON
ETS-L-PROTEIN
AN
DIE
DECOY-SEQUENZ
(GEL-RETARDATIONSEXPERIMENTE)
.
98
4.3.2.4.
KONDITIONIERTE
HT-1080-ZELLEXTRAKTE
IM
ETS-L-GEL
RETARDATIONSEXPERIMENT
.
103
5.
DISKUSSION.
106
5.1.
SYNOVIALFIBROBLASTEN
.
107
5.2.
DIE
PROTEASENEXPRESSION
DER
FIBROSARKOMZELLEN
.
109
5.3.
EXPRESSION
UND
INHIBITION
VON
ETS-1
.
111
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
120
7.
LITERATURVERZEICHNIS.
.
121 |
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