Entwicklung und Applikation neuartiger Verfahren zur differentiellen Genexpressionsanalyse: DASH und NewRACE
Saved in:
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
München
Utz, Wiss.
2000
|
| Series: | Biotechnologie
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | VII, 193 S. Ill. : 21 cm |
| ISBN: | 3896757679 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DIFFERENTIELLE
GENEXPRESSIONSANALYSE
.
2
1.1.1
NEUERE
VERFAHREN
.4
1.1.2
RDA
.
6
1.1.3
DASH
.
9
1.2
RACE
.
12
1.2.1
CLASSICRACE
.
13
1.2.2
NEWRACE
.
13
1.3
ZIELSETZUNG
.
16
2
MATERIAL
.
17
2.1.1
GERAETE
.
17
2.1.2
CHEMIKALIEN
.
18
2.1.3
KITS
.20
2.1.4
ENZYME
.20
2.1.5
ANTIKOERPER
UND
KONJUGATE
.
21
2.1.6
LOESUNGEN,
PUFFERUND
MEDIEN
.
21
2.1.7
KULTURMEDIEN
.
21
2.1.8
ZELLLINIEN
.
21
2.1.9
BAKTERIENSTAMM
.
21
2.1.10
VEKTOREN
.
21
2.1.11
OLIGONUKLEOTIDE
.
21
2.1.12
DNA
UND
RNA-LAENGENSTANDARDS
.
21
3
METHODEN
.
21
3.1
ZELLBLOLOGLSCHE
METHODEN
.
21
3.1.1
ZELLKULTUR
VON
ADHAERENTEN
ZELLEN
.
21
3.1.2
ZELLKULTUR
VON
SUSPENSIONSZELLEN
.
21
3.2
ALLGEMEINE
MOLEKULARBLOLOGLSCHE
METHODEN
.
21
3.2.1
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN.
21
3.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
21
3.2.1.2
PRAEPARATION
VON
MRNA
.
21
3.2.1.3
PHENOL/CHLOROFORM
EXTRAKTION
.
21
3.2.1.4
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
21
3.2.1.6
MIKROZENTRIFUGATION
.
21
3.2.1.6
SPEKTROSKOPISCHE
QUANTIFIZIERUNG
.
21
3.2.1.7
AGAROSE-GELELEKTROPHOSE
.
21
3.2.1.8
DNA
ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
.
21
3.2.1.9
DNA
ISOLIERUNG
AUS
PCR
UND
RESTRIKTIONSANSAETZEN
.
21
3.2.1.10
RNA
REINIGUNG
UEBER
SILIKAMATRIX-SAEULEN
.
21
3.2.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
21
3.2.3
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
DNA.
21
3.2.3.1
LIGATION
VON
DNA
.
21
3.2.3.2
TRANSFORMATION
UND
KULTIVIERUNG
VON
E.COLI
.
21
3.2.3.3 PLASMIDPRAEPARATION
AUS
E.COLI
.
21
3.2.3.4
KOLONIE-PCR
.
21
3.2.3.S
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
.
21
3.2.3.6
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
21
3.2.4
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
21
3.2.4.1
DNA
MARKIERUNG
DURCH
KLENOW-ENZYM
.
21
3.2.4.2
DNA
MARKIERUNG
DURCH
3
'
-ENDEN
AUFFUELLREAKTION
.
21
3.2.4.3
HERSTELLUNG
VON
MARKIERTEN
PCR-FRAGMENTEN
(CAT,
PUC19,
LAMBDA,
E.COLI)
.
21
3.2.4.4
RNA
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
21
3.2.4.5
RNA
MARKIERUNG
DURCH
DIG-CHEM-LINK
DERIVATISIERUNG
.
21
3.2.5
ANALYSE
UND
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
21
3.2.5.1
SOUTHERN
BLOT
.
21
3.2.5.2
NORTHERN
BLOT
.
21
3.2.5.3
REVERSER
NORTHERN
BLOT
.
21
3.2.5.4
QUANTITATIVE
PCR
MIT
LIGHTCYCLER
.
21
II
3.3
SPEZIFISCHE
METHODEN
DES
DASH-VERFAHRENS.
.
21
3.3.1
PRAEPARATION
VON
TESTER
UND
DRIVER
.
21
3.3.1.1
DOPPELSTRANGIGE
CDNA-SYNTHESE
.
21
3.3.1.2
RESTRIKTIONSENDONUKLEASE
VERDAU
.
21
3.3.1.3 LIGATION
VON
ADAPTOREN
.
21
3.3.1.4
DASH-SPEZIFISCHE
PCR-AMPLIFIZIERUNG
.
21
3.3.2
HYBRIDISIERUNGSREAKTIONEN
.
21
3.3.2.1
STANDARDHYBRIDISIERUNG
.
21
3.3.2.2
PERT-REAKTION
.
21
3.3.2.3
CTAB-REAKTION
.
21
3.3.3
SELEKTIONSVERFAHREN
.
21
3.3.3.1
SELEKTION
AN
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTEN
.
21
3.3.3.2
SELEKTION
AN
ANTI-DIGOXIGENIN-MIKROTITERPLATTEN
.
21
3.3.3.3
SELEKTION
AN
STREPTAVIDIN-BESCHICHTETEN
MAGNETPARTIKELN
.
21
3.3.3.4
SELEKTION
AN
ANTI-DIGOXIGENIN-BESCHICHTETEN
MAGNETPARTIKELN
.
21
3.3.3.5
SELEKTION
AN
BESCHICHTETEN
PCR-STRIPS
.
21
3.3.4
T
RANSFERVERFAHREN
.
21
3.3.4.1
ALKALISCHER
T
RANSFER
.
21
3.3.4.2
PROTEOLYTISCHER
TRANSFER
.
21
3.3.4.3
SPEZIFISCHE
DESORPTION
.
21
3.3.5
ANALYTISCHE
METHODEN
.
21
3.3.5.1
BIOTIN/DIGOXIGENIN
BZW.
FLUORESZEIN
ELISA
.
21
3.3.5.2
SOUTHERNELISA
.
21
3.4
SPEZIFISCHE
METHODEN DES
NEWRACE-VERFAHRENS
.
21
3.4.1
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
RNA
.
21
3.4.2 CAP-SPALTUNG
MIT
TAP
.
21
3.4.3
LIGATION
MIT
T4
RNA
LIGASE
.
21
3.4.3.1
LIGATION
VON
HYBRIDOLIGONUKLEOTLDEN
.
21
3.4.3.2
LIGATION
VON
RNA
.
21
III
3.4.4
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
21
3.4.5
NEWRACE-SPEZIFISCHE
PCR-AMPLIFIZIERUNG.
21
3.4.6
DIFFERENTIAL
DISPLAY
TECHNIK
.
21
4
ERGEBNISSE
.
21
4.1
DASH-VERFAHRENSENTWLCKLUNG
.
21
4.1.1
STREPTAVIDIN-BIOTIN
SELEKTION
.
21
4.1.1.1
BINDUNG
AN
DIE
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
(SA-MTP)
NACH
HYBRIDISIERUNG
.
21
4.1.1.2
SALZEINFLUSS
DER
DNA-BINDUNG
AN
DIE
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.1.3
BINDEKAPAZITAET
DER
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.1.4
BINDEKINETIK
DER
DNA
AN
DIE
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.1.5
SELEKTIVITAET
DER
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.2
TRANSFER
VON
STREPTAVIDIN
AUF
ANTI-DIGOXIGENIN
.
21
4.1.2.1
ALKALISCHER
TRANSFER
VON
DER
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.2.2
TRANSFERSTABILISIERUNG
DURCH
DETERGENZ
.
21
4.1.2.3
VALIDIERUNG
DES
VOLLSTAENDIGEN
TRANSFERS
.
21
4.1.2.4
PROTEOLYTISCHER
TRANSFER
VON
DER
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.2.5
THERMISCHE
INAKTIVIERUNG
.
21
4.1.2.6
PROTEOLYSEKINETIK
DER
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.3
ANTI-DIGOXIGENIN
SELEKTION
.
21
4.1.3.1
SELEKTION
AN
DER
ANTI-DIGOXIGENIN
MIKROTITERPLATTE
(AD-MTP)
.
21
4.1.3.2 DNA-BINDEKINETIK
AN
DIE
ANTI-DIGOXIGENIN
MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.3.3
DETERGENTIENEINFLUSS
AUF
DIE
BINDUNG
AN
DIE
ANTI-DIGOXIGENIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.3.4
SELEKTIVITAET
DER
ANTI-DIGOXIGENIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.4
TRANSFER
VON
DER
ANTI-DIGOXIGENIN
MATRIX
IN
DIE
PCR
.
21
4.1.4.1
ALKALISTABILITAET
DER
ANTI-DIGOXIGENIN
MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.4
2
PROTEOLYTISCHER
TRANSFER
VON
DER
ANTI-DIGOXIGENIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.4.3
TRANSFER
IN
ANTI-DIGOXIGENIN-BESCHICHTETE
PCR-STRIPS
.
21
4.1.4.4
DESORPTIVER
TRANSFER
VON
DER
ANTI-DIGOXIGENIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
4.1.5
HYBRIDISIERUNGSBESCHLEUNIGUNG
.
21
IV
4.1.5.1
PHENOL-EMULSION-REASSOZIATIONS-TECHNIK
(PERT)
.
21
4.1.5.2
SUBTRAKTIVE
PERT-HYBRIDISIERUNG
.
21
4.1.5.3
MODIFIKATION
DES
PERT-VERFAHRENS
.
21
4.1.5.4
PERT
KOMPLETTSUBTRAKTION
.
21
4.1.5.5
HYBRIDISIERUNGSBESCHLEUNIGUNG
DURCH
CTAB
.
21
4.1.5.6
CTAB
HYBRIDISIERUNGSKINETIK
.
21
4.1.6
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
.
21
4.1.6.1
PCR-ZYKLENZAHL
.
21
4.1.6.2
EXTENSIONSDAUER
.
21
4.1.6.3
ANNEALINGTEMPERATUR
.
21
4.1.6.4
PRIMERKONZENTRATION
.
21
4.1.6.5
TESTSYSTEM
LAMBDA/PUC19
.
21
4.1.6.6
PCR-REAMPLIFIZIERUNGSEFFEKT
.
21
4.2
DASH-APPLLKATLON
IM
MODELLSYSTEM
MCF-7/
MCF-7
ADR
.
21
4.2.1
PRAKTISCHE
VERFAHRENSFUEHRUNG
.
21
4.2.2
IDENTIFIZIERUNG
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTER
KANDIDATENGENE
.
21
4.2.3
VORSELEKTION
DURCH
REVERSEN
NORTHERN
BLOT
.
21
4.2.4
VERIFIKATION
DURCH
NORTHERN
BLOT
.
21
4.2.5
LIGHTCYCLER
QUANTIFIZIERUNG
.
21
4.3
OPTIMIERUNG
DES
NEWRACE-VERFAHRENS
.
21
4.3.1
ALLGEMEINE
MODIFIKATIONEN
DES
NEWRACE-VERFAHRENS
.
21
4.3.2
MODIFIZIERTE
LIGATION
MIT
HYBRIDEM
OLIGONUKLEOTID
.
21
4.3.3
VERFAHRENSVALIDIERUNG
DURCH
CAT
IN
VITRO
TRANSKRIPT
.
21
4.3.4
TEST
DES
MODIFIZIERTEN
NEWRACE-VERFAHRENS
AN
SS-AKTIN
.
21
4.4
APPLIKATION
DES
OPTIMIERTEN
NEWRACE-VERFAHRENS
.
21
4.4.1
GANZLAENGEN-KLONIERUNG
DER
PAP-CDNA
IM
MODELL
MCF-7/MCF-7
AOR
.
21
4.4.2
GANZLANGEN-KLONIERUNG
NEU
ENTDECKTER
CDNAS
BEI
FANCONI
ANAEMIE
.
21
4.4.2.1
GANZLAENGEN-KLONIERUNG
DER
COS-CDNA.
21
4.4.2.2
GANZLAENGEN-KLONIERUNG
DER
C016-CDNA
.
21
V
5
DISKUSSION
.21
5.1
AUSGANGSBASIS
DES
DASH-VERFAHRENS
.
21
5.2
MERKMALE
DES
DASH-VERFAHRENS
.
21
5.3
SELEKTLONSVERFAHREN
.
21
5.3.1
STREPTAVIDIN-BIOTIN
SELEKTION
.
21
5.3.2
BINDUNG
AN
STREPTAVIDIN
UNTER
STRINGENTEN
BEDINGUNGEN
.
21
5.3.3 EINFLUSS
VON
NACI
AUF
DIE
BINDUNG
VON
DNA
.
21
5.3.4 DNA-BINDEKAPAZITAET
UND
-
KINETIK
DER
STREPTAVIDIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
5.3.5
SELEKTIVITAET
DER
IMMOBILISIERUNG
AN
STREPTAVIDIN
.
21
5.3.6
ANTI-DIGOXIGENIN
SELEKTION
.
21
5.3.7
STABILITAET
DER
ANTI-DIGOXIGENIN-HAPTEN-BINDUNG
.
21
5.3.8
DNA-BINDEKINETIK
DER
ANTI-DIGOXIGENIN-MIKROTITERPLATTE
.
21
5.3.9
SELEKTIVITAET
DER
IMMOBILISIERUNG
AN
ANTI-DIGOXIGENIN
.
21
5.4
TRANSFERVERFAHREN
.
21
5.4.1
ALKALISCHER
TRANSFER
.
21
5.4.2
PROTEOLYTISCHER
T
RANSFER
.
21
5.4.3
DESORPTIVER
T
RANSFER
.
21
5.5
HYBRIDISIERUNGSVERFAHREN
.
21
5.5.1.1
PHENOL-EMULSION-REASSOZIATIONS-TECHNIK
(PERT)
.
21
5.5.1.2
CTAB
HYBRIDISIERUNGSBESCHLEUNIGUNG
.
21
5.6
PCR
.
21
5.7
DASH
APPLIKATION
.
21
5.7.1
CYTOKERATIN
19
.
21
5.7.2 LACTATDEHYDROGENASE
B
.
21
5.7.3
LIPOCORTIN
1.
21
5.8
NEWRACE
OPTIMIERUNG
.
21
5.8.1
NEWRACE-KLONIERUNG
PAP.
.
21
5.8.2
NEWRACE-KLONIERUNG
CO9
.
21
5.8.3
NEWRACE-KLONIERUNG
CO16
.
21
VI
6
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
.
21
7
ANHANG
I:
DASH
APPLIKATION
FA
UND
T-ALL
.21
8
ANHANG
II:
LIGHTCYCLER-ANALYSEN
.
21
9
ANHANG
III:
SEQUENZIERUNGSDATEN
.
21
9.1
SEQUENZEN
DER PCR-REATNPLLFLZLERUNGSEFFEKT-KLONE
.
21
9.2
SEQUENZEN
DER
DASH-APPLIKATLON
MCF-7/MCF-7
ADR
.
21
9.3
SEQUENZEN
DER
DASH-APPLIKATLON
FANCONI
ANAEMIE
UND
T-ALL
.
21
10
LITERATURVERZEICHNIS
.
21
VII |
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