Untersuchungen zur molekularen Interaktion zwischen dem Peptidhormon Corticotropin-Releasing Factor und seinem Rezeptor:
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Göttingen
Cuvillier
2000
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Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Abkürzungen !
2. Einleitung 4
2.1 Historie 5
2.2 Homologie der verschiedenen Peptidhormone 6
2.3 Physiologische Bedeutung von CRF 7
2.4 CRF Rezeptoren 9
2.5 Das CRF Binding Protein 11
2.6 Bindungsstellen der Peptidhormone an den Rezeptor 13
2.7 Fotoaffinitätsmarkierung 15
2.7.1 Arylazide 17
2.7.2 Diazoverbindungen 18
2.7.3 Aryldiazoniumsalze 18
2.7.4 Diazirine 19
2.7.5 Benzophenone 20
3. Aufgabenstellung 22
4. Ergebnisse 24
4.1 Synthese fotoaktivierbarer Verbindungen 24
4.1.1 Synthese von 3 {Trifluormethyl) 3 (m aminophenyl) diazirin (TAD) 25
4.1.2 Verbesserte Synthese von TAD mit t BOC Schutzgruppe 27
4.1.3 Synthese von 4 ( 1 Azi 2,2,2 trifluorethyl)benzoesäure (ATB) 29
4.1.4 Kristallstruktur von 4 ( 1 Azi 2,2,2 trifluorethyl) benzoesäure 30
4.2 Synthese fotoaktivierbarer Peptide 33
4.2.1 Synthese ein und zweifach derivatisierter oCRF Antagonisten 36
4.3 Synthetisierte Peptide mit Biotin / Fluorescein Gruppe und 38
Diazirin Funktion
4.4 Bestrahlungsexperimente 39
4.5 Bindungsaffinitäten und biologische Aktivität der oCRF Analoga 40
4.6 PAL Experimente 42
4.6.1 Detektion mit Stcepta. idin Horseraddishperoxidase (SA HRP) 43
4.6.2 Deglycosylierung des rCRF Rezeptors 44
Inhaltsverzeichnis
4.6.3 Detektion mit Streptavidin Alkalischer Phosphatase (SA AP) 45
4.6.4 Crosslink Detektion nach Deglycosylierung des rCRF Rezeptors 46
4.7 Fotoaffinitätsmarkierung des rat Binding Protein 47
4.7.1 Synthese von photoaktivierbaren Peptiden für das PAL am rat 48
Binding Protein
4.7.2 Bindungsaffinitäten der rUcn Analoga 49
4.7.3 Fotoaffinitätsmarkierung des ratCRF Binding Protein 50
4.8 Schild Analyse von Astressin und Antisauvagine 30 52
4.8.1 SCHILD Analyse am rCRF Rl 53
4.8.2 SCHILD Analyse am mCRF R2ß 55
5. Material und Methoden 58
5.1 Reagentien 58
5.2 Chromatographische Trennmethoden 58
5.3 Spektroskopie 59
5.4 Peptidchemische Methoden 60
5.4.1 Synthese der Peptide am Trägerharz 60
5.4.2 Abspaltung der Peptide vom Trägerharz 61
5.4.3 Aminosäureanalyse 62
5.5 Bestrahlungsexperimente 63
5.6 Proteinchemische Experimente 63
5.6.1 Proteinkonzentrationsbestimmung 63
5.6.2 Eindimensionale SDS Polyacrylamidgelelektrophorese 63
5.6.3 Proteintransfer aus Polyacrylamidgelen auf PVDF Membran 65
(Westem Blot)
5.6.4 Proteinfärbung 66
5.6.5 Immunologische Detektion von Proteinen auf PVDF Membran 66
5.7 Deglycosylierungen 67
5.8 Zellkultur 68
5.8.1 Allgemein 68
5.8.2 Zentrifugation der Zellen 68
5.8.3 Kultivierung der Zellen 69
5.8.4 Auftauen der Zellen 69
5.8.5 Teilung der Adhäsionskulturen
5.8.6 Membranpräparation aus Zellen
5.9 Messung der Agonisten induzierten cAMP Produktion 70
Inhaltsverzeichnis
5.10 Sättigungsanalyse an rCRF Rl Membranpräparationen 71
5.11 Kompetitionsexperimente an rCRF Rl Membranpräparationen 72
6. Durchführung der Versuche 73
6.1 Synthese der Diazirine 73
6.2 Allgemeine Syntheseschemata für ein und zweifach derivatisierte 82
oCRF Analoga mit Diazirin als PAL Komponente
6.3 Syntheseschemata für Peptide mit Benzophenon Rest als 85
fotoaktivierbarer Gruppe
6.4 Durchführung der Bestrahlungsexperimente 85
7. Diskussion 87
7.1 Synthese fotoaktivierbarer Verbindungen 87
7.2 Röntgenkristallographische Strukturermittlung von ATB 88
7.3 Fotoaktivierbare Peptide 91
7.3.1 Synthese 91
7.3.2 Affinität der Peptide zu den Rezeptorproteinen 92
7.4 Fotoaffinitätsmarkierung der CRF Rezeptorproteine 95
7.4.1 rat CRF Rezeptor 1 96
7.4.2 rat CRF Binding Protein 98
7.4.3 Vergleich von Diazirinen und Benzophenonen als fotoaktivierbare 99
Gruppe für die Fotoaffinitätsmarkierung
7.5 SCHILD Analyse von Astressin und Antisauvagine 30 an 101
verschiedenen CRF R Subtypen
8. Zusammenfassung 103
9. Literaturverzeichnis 105
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