Genetische Untersuchungen zur Entstehung von adhärenten Biofilmen von Staphylococcus epidermidis auf Kunststoffoberflächen:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. KOAGULASENEGATIVE STAPHYLOKOKKEN 1
1.1.1. KLASSIFIKATION 1
1.1.2. ERKRANKUNGEN DURCH KOAGULASENEGATIVE STAPHYLOKOKKEN 3
1.1.3. PATHOGENESE VON DURCH
S. EPIDERMIDIS VERURSACHTEN FREMDKOERPERINFEKTIONEN 5
1.2. VORAUSSETZUNGEN FUER DIESE ARBEIT 7
1.3. ZIELE DIESER ARBEIT 9
2. MATERIAL UND METHODEN 11
2.1. MATERIAL 11
2.1.1. GERAETE 11
2.1.2. CHEMIKALIEN 11
2.1.3 . NAEHRMEDIEN 12
2.1.4. ENZYME 12
2.1.5. PUFFER 12
2.1.6. BAKTERIENSTAEMME 13
2.1.7.
S. EPIDERMIDIS-PHAGEN 15
2.1.8. KANINCHENANTISEREN GEGEN S. EPIDERMIDIS-STAEMME 15
2.2. METHODEN 16
2.2.1. ADHAERENZTEST ZUR SEMIQUANTITATIVEN BESTIMMUNG DER BIOFILMBILDUNG
VON
BAKTERIENSTAEMMEN AN PLASTIKOBERFLAECHEN 16
2.2.2. SEMIQUANTITATIVER KOAGGLUTINATIONSTEST FLIR BIOFILMSPEZIFISCHES
ANTIGEN (PIA) 17
2.2.3. INDIREKTER IMMUNFLUORESZENZTEST 19
2.2.4. RESISTENZBESTIMMUNG DER BAKTERIENSTAEMME AUF MUELLER-HINTON-AGAR 19
2.2.5. NACHWEIS DER BIOFILMBILDUNG AUF KONGOROT-AGAR 20
2.2.6. ISOLIERUNG VON SPONTANPHASENVARIANTEN MIT BIOFILMNEGATIVEM
PHAENOTYP 21
2.2.7. TRANSPOSONMUTAGENESE MIT DEM PLASMID PTVLTS 21
2.2.8. PLASMIDISOLIERUNG AUS STAPHYLOKOKKEN 22
2.2.9. ISOLIERUNG CHROMOSOMAL' DNA 23
2.2.10. SPALTUNG VON DNA MIT HILFE VON RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 24
2.2.11. DNA-FRAGMENTAUFTRENNUNG IN DER AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.12. SOUTHERN BLOT HYBRIDISIERUNG VON PLASMID- UND CHROMOSOMALER DNA
26
2.2.13. PHAGENTRANSDUKTION 29
2.2.14. PLASMIDCURING MIT HILFE VON NATRIUM-DODECYLSULFAT (SDS) 32
2.2.15. PRAEPARATION VON ZELLEXTRAKTEN ZUR SEROLOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG VON SAA 34
2.2.16. OUCHTERLONY DOPPELIMMUNDIFFUSIONSANALYSE 34
3. ERGEBNISSE
36
3.1. CHARAKTERISIERUNG DER TRANSPOSON TN917-MUTANTEN ML BIS M14
36
3.1.1. VORBEMERKUNG 36
3.1.2. WEITERE PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRANSPOSONMUTANTEN 36
3.1.3. NACHWEIS DER GENETISCHEN KOPPLUNG VON PHAENOTYPAENDERUNG UND
TRANSPOSON-
INSERTION DURCH PHAGENTRANSDUKTION 38
3.1.31. BESTIMMUNG DER RATE DER SPONTANVARIATION DES
S. EPIDERMIDIS-
STAMMES 13-1 38
3.1.3.2. PHAGENTYPISIERUNG VON
S. EPIDERMIDIS 9142 41
3.1.3.3. TRANSDUKTION DES TRANSPOSONS TN917 DER TRANSPOSONMUTANTEN ML
BIS M14
UND VON PLASMID PTVLTS AUS 13-1 IN DEN WILDTYP 9142 42
3.1.3.4. SOUTHERN BLOT-ANALYSE DER TRANSPOSONINSERTION BEI DEN
TRANSPOSONMUTAN
TEN UND DEN TRANSDUKTANTEN 46
3.2. TRANSDUKTION DES PLASMIDES PTVLTS UND DER CHROMOSOMALEN
TN917-INSER-
TIONEN VON MIO UND ML 1 IN VERSCHIEDENE
S. EPIDERMIDIS-STAMME 48
3.2.1. TRANSDUKTION DER TN917-INSERTIONEN VON MIO UND ML 1 IN DIE VON
9142
UNABHAENGIGEN BIOFILMBILDENDEN
S. EPIDERMIDIS-ISOLATE 1437 UND 8400 48
3.2.2. UEBERPRUEFUNG DER TRANSDUKTANTEN AUS 3.2.1. AUF WIEDERHOLBARE
TRANSDUZIERBAR-
KEIT DER TN917-INSERTIONEN 48
3.2.3. TRANSDUKTION DES PLASMIDES PTVLTS IN DIE VON 9142 UNABHAENGIGEN
BIOFILMBILDENDEN S. EPIDERMIDIS-ISOLATE 1457 UND 8400 UND UEBERPRUEFUNG
DES
PLASMIDES IN DEN EMPFANGERSTAEMMEN AUF SEINE FUNKTIONALITAET 30
3.3. ENTWICKLUNG EINES FUER DIE ISOLIERUNG CHROMOSOMALER
TRANSPOSONMUTANTEN
EFFIZIENTEN TRANSPOSONMUTAGENESESYSTEMS 52
3.3.1. VORBEMERKUNG 52
3.3.2. MARKIERUNG DES PLASMIDES PL457 VON
S. EPIDERMIDIS 1457-PTVLTS UND
DARSTELLUNG DER PRAEFERENZ DES TRANSPOSONS TN917 FUER PLASMIDINSERTIONEN
52
3.3.3. BESTIMMUNG DER RATE DER SPONTANVARIATION BEI
S. EPIDERMIDIS 1457 55
3 3.4 KONSTRUKTION EINES CHROMOSOMALEN TRANSPOSONMUTAGENESESYSTEMS AUS
S. EPIDERMIDIS
1457 55
3.3.4.1. ELIMINATION DES KRYPTISCHEN PLASMIDES VON
S. EPIDERMIDIS 1457-118 UND
1457-1111 IN GEGENWART VON NATRIUM-DODECYLSULFAT 55
3.3.4.2. TRANSDUKTION DES PLASMIDES PTVLTS AUS 13-1 IN DIE PLASMIDFREIEN
STAEMME
1457CL, 1457C2 UND 1457C3 57
3.3.4.3. INSERTIONSVERHALTEN DES TRANSPOSONS TN917 BEI DER TRANSPOSITION
IN DAS
CHROMOSOM VON 1457C 58
3.4. ISOLIERUNG WEITERER TRANSPOSON TN917-MUTANTEN UNTER
VERWENDUNG DES IN 3.3. ENTWICKELTEN TRANSPOSONMUTAGENESESYSTEMS
63
3 .4.1. DURCHFUEHRUNG DER TRANSPOSONMUTAGENESE UND ISOLIERUNG DER
BEZUEGLICH BIOFILM
BILDUNG AUFFAELLIGEN TRANSPOSONMUTANTEN 63
3 .4.2. PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRANSPOSONMUTANTEN 63
3.4.3. NACHWEIS DER GENETISCHEN KOPPLUNG VON PHAENOTYPAENDERUNG UND
TRANSPOSON-
INSERTION DURCH PHAGENTRANSDUKTION 65
3.4.4. SOUTHERN BLOT-ANALYSE DER TRANSPOSONINSERTIONEN BEI DEN
TRANSPOSONMUTANTEN
UND DEN TRANSDUKTANTEN 67
3 .4.5. CHARAKTERISIERUNG VON TRANSPOSONMUTANTEN MIT EINEM AUF
PURPLE-AGAR, SUPPL.
MIT 0,4 % N-ACETYLGLUCOSAMIN VERAENDERTEN PHAENOTYP 72
3.5. IMMUNOLOGISCHE UNTERSCHEIDUNG DES INTERZELLULAEREN POLYSACCHARID
ANTIGENS
(PIA) VON SAA 76
3.5.1. VORBEMERKUNG 76
3.5.2. DARSTELLUNG VON SAA UND UEBERPRUEFUNG DER SPEZIFITAET DIESES
ANTIGENS ANHAND
WEITERER
S. EPIDERMIDIS- STAEMME 76
3.5.3. AUSSCHLUSS EINER VERWANDTSCHAFT VON PIA UND SAA 79
4. DISKUSSION 82
5. ZUSAMMENFASSUNG 95
6. LITERATURVERZEICHNIS 97
7. DANKSAGUNG 107
8. LEBENSLAUF 108 |
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