Untersuchungen zur BMP-4 induzierten Repression des XFD-1' Gens in Xenopus laevis: Funktion und Regulation des Homeobox Transkriptionsfaktors Xvent-1B
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
DIE
FRUEHE
ENTWICKLUNG
VON
XENOPUS
LAEVIS
1
1.2
KEIMBLATTINDUKTION
2
1.2.1
KLASSISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
AMPHIBIENKEIMEN
2
1.2.2
INDUKTION
DES
ORGANISATORS:
MESODERMINDUKTION
3
1.2.3
SIGNALWEGE
DER
MESODERMINDUKTION:
DORSO-VENTRALE
ACHSENBILDUNG
4
1.3
REGULATION
MESODERMAL
EXPRIMIERTER
GENE
5
1.3.1
DER
TGF-SS
SIGNALWEG
5
1.3.2
WNT-SIGNALKASKADE
6
1.3.3
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
IN
DER
EMBRYONAIENTWICKLUNG
7
1.4
DIE
REGULATION
DES
FORK
HEAD
GENS
XFD
1'
8
2
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
9
3
MATERIAL
UND
METHODEN
10
3.1
MATERIAL
10
3.1.1
CHEMIKALIEN
10
3.1.2
ENZYME
UND
KITS
11
3.1.3
RADIOAKTIVITAET
UND
ANTIKOERPER
11
3.1.4
PLASMIDE
11
3.1.5
PCR-PRIMER
12
3.1.6
DNA-KONSTRUKTE
FUER
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
13
3.2
METHODEN
14
3.2.1
MOLEKULARBIOLOGIE
14
3.2.1.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
ZELLEN
14
3.2.1.2
TRANSFORMATION
14
3.2.1.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
15
3.2.1.3.1
LICL-METHODE
(WILMZIG,
1985)
15
3.2.1.3.2
QIAGEN
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(ENDOTOXIN
FREI)
15
3.2.1.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
16
3.2.1.5
QIAEX-ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
16
3.2.1.6
RESTRIKTIONSVERDAU
17
3.2.1.7
FILL-IN
REAKTION
MIT
KLENOW
FRAGMENT
17
3.2.1.8
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-DNA
17
3.2.1.9
LIGATION
17
II
_
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.10
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
DNA
MITTELS
PCR
17
3.2.1.11
AUFREINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
18
3.2.1.12
HERSTELLUNG
VON
RNA
18
3.2.1.12.1
HERSTELLUNG
DER
TEMPLATE
DNA
18
3.2.1.12.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
19
3.2.1.12.3
AUFREINIGUNG
DER
TRANSKRIPTIONSPRODUKTE
19
3.2.2
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
19
3.2.2.1
BAKTERIELLE
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
19
3.2.2.2
REINIGUNG
BAKTERIELL
EXPRIMIERTER
PROTEINE
20
3.2.2.2.1
AUFREINIGUNG
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
20
3.2.2.2.2
NATIVE
AUFREINIGUNG
VON
PROTEINEN
21
3.2.2.3
DIALYSE
VON
PROTEINEN
21
3.2.2.4
SDS-POLYACRY)AMIDGELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE)
22
3.2.2.5
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
23
3.2.3
METHODEN
ZUM
NACHWEIS
VON
DNA-PROTEIN
WECHSELWIRKUNGEN
23
3.2.3.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
23
3.2.3.1.1
MARKIERUNG
DURCH
FILL-IN
REAKTION
23
3.2.3.1.2
ENDSTAENDIGE
MARKIERUNG
MIT
POLYNUKLEOTIDKINASE
23
3.2.3.1.3
REINIGUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
DNA-FRAGMENTE
24
3.2.3.1.4
AUTORADIOGRAPHIE
24
3.2.3.2
GEL-RETARDATIONS
EXPERIMENTE
25
3.2.3.3
YYFOOTPRINT
"
EXPERIMENTE
25
3.2.3.3.1
A/G
SPALTUNG
NACH
MAXAM-GILBERT
(1980)
26
3.2.3.3.2
DNASE
I-FOOTPRINT
26
3.2.4
ARBEITEN
MIT
XENOPUS
LAEVIS
27
3.2.4.1
EIREIFUNG
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
FERTILISATION
27
3.2.4.2
ENTFERNEN
DER
GALLERTHUELLE
UND
MIKROINJEKTION
28
3.2.4.3
WHOLE
MOUNT
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
28
3.2.4.3.1
FIXIEREN
VON
XENOPUS
LAEVIS
EMBRYONEN
30
3.2.4.3.2
HERSTELLUNG
DIGOXYGENINMARKIERTER
ANTISENSE
RNA-SONDEN
30
3.2.4.3.3
WHOLE
MOUNT
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
30
3.2.4.3.4
BLEICHEN
UND
DURCHSICHTIGMACHEN
VON
XENOPUS
LAEVIS
EMBRYONEN
32
3.2.4.4
LUZIFERASE
ASSAY
33
3.2.4.5
RT-PCR
33
3.2.4.5.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
XENOPUS
EMBRYONEN
33
3.2.4.5.2
CDNA
SYNTHESE
34
INHALTSVERZEICHNIS
_
LH
3.2.4.5.3
PCR
34
4
ERGEBNISSE
35
4.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
INHIBIERUNG
VON
XFD-1
'
DURCH
BMP-4
35
4.1.1
BMP-4
UNTERDRUECKT
DIE
XFD
1'
TRANSKRIPTION
35
4.1.2
SMADL
UND
XVENT
1
HABEN
DIE
GLEICHEN
EFFEKTE
WIE
BMP-4
36
4.1.3
XVENT-1
INHIBIERT
XFD-1'
UEBERDAS
BMP-4
GESTEUERTE
BIE
37
4.1.4
XVENT
1
BINDET
AN
DAS
BMP-INHIBITORISCHE
ELEMENT
(BIE)
40
4.2
DIE
REGULATION
DER
XVENT
1
EXPRESSION
42
4.2.1
AKTIVITAETEN
DES
XVENT-1B
PROMOTORS
43
4.2.2
REGULATION
DES
XVENT
1B
PROMOTORS
45
4.2.3
XVENT-IB
STEHT
IM
BMP-4
SIGNALWEG
UNTERHALB
VON
XVENT-2B
46
4.2.4
XVENT
1B
IST
KEIN
DIREKTES
ZIELGEN
DES
BMP-SIGNALWEGS
50
4.3
EINFLUSS
VON
GATA2A
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
XVENT
1B
51
4.3.1
GATA2A
KANN
DEN
EFFEKT
VON
XVENT-2
P(40)
AUFHEBEN
52
4.3.2
GATA2A
UND
XVENT-2
BINDEN
AN
DEN
XVENT-IB
PROMOTER
53
4.3.3
AKTIVITAETEN
DER
XVENT-2
UND
GATA2A
ELEMENTE
IM
XVENT-IB
PROMOTER
56
5
DISKUSSION
61
5.1
DIE
REGULATION
VON
XFD-1'WAEHREND
DER
GASTRULATION
61
5.1.1
BMP-4
INHIBIERT
XFD
1'
DURCH
AKTIVIERUNG
VON
XVENT
1
62
5.1.2
XVENT
1
UNTERDRUECKT
XFD-1'
DURCH
BINDUNG
AN
DAS
BIE
63
5.2
DIE
FUNKTION
VON
XVENT
PROTEINEN
IM
BMP-SIGNALWEG
64
5.2.1
DIE
REGULATION
VON
XVENT
1B
64
5.2.2
DAS
EPISTATISCHE
VERHAELTNIS
VON
XVENT-IB
UND
XVENT-2B
65
5.2.3
XVENT-2B
REICHT
NICHT
ZUR
AKTIVIERUNG
VON
XVENT
1
B
AUS
66
5.3
DIE
FUNKTION
VON
GATA2A
BEI
DER
REGULATION
VON
XVENT
1
B
67
5.3.1
GATA2A
AKTIVIERT
DEN
XVENT
1B
PROMOTER
67
5.3.2
ZIELSEQUENZEN
FUER
GATA2A
UND
XVENT-2
AUF
DEM
XVENT-IB
PROMOTER
68
5.3.3
EINFLUSS
DER
XVENT-2
UND
GATA2A
ELEMENTE
AUF
DIE
AKTIVIERUNG
VON
XVENT-IB
69
5.4
EINFLUSS
VON
WNT-8
AUF
DIE
REGULATION
VON
XVENT
1B
71
6
ZUSAMMENFASSUNG
72
7
LITERATURVERZEICHNIS
74 |
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| title_short | Untersuchungen zur BMP-4 induzierten Repression des XFD-1' Gens in Xenopus laevis |
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| title_sub | Funktion und Regulation des Homeobox Transkriptionsfaktors Xvent-1B |
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