Einsatz der Reversen Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis von Rotaviren in Schlachtschweinen:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZIELSTELLUNG
1
2.
EINLEITUNG
2
2.1.
VIREN
IN
LEBENSMITTELN
2
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
ROTAVIREN
4
BAU
UND
STRUKTUR
DER
ROTAVIREN
4
ANTIGENE
EIGENSCHAFTEN
DER
ROTAVIREN
5
DAS
GENOM
DER
ROTAVIREN
5
2.3.
DIE
ROTAVIRUSINFEKTION
7
2.3.1.
2.3.2.
2.3.2.1.
2.3.3.
BEDEUTUNG
DER
ROTAVIRUSINFEKTION
9
UEBERTRAGUNG
DER
ROTAVIREN
10
WECHSELSEITIGE
UEBERTRAGUNG
11
EXTRAINTESTINALE
INFEKTION
12
2.4.
PORCINE
ROTAVIREN
13
2.4.1.
2.4.2.
GESCHICHTE
13
ROTAVIRUSINFEKTION
DES
SCHWEINES
14
2.5.
DIAGNOSTIK
DER
ROTAVIRUSINFEKTION
15
2.5.1.
2.5.2.
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
16
ANWENDUNG
DER
REVERSEN
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
ZUM
NACHWEIS
VON
ROTAVIREN
17
2.6.
TRANSLOKATION
ENTERALER
ERREGER
19
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
21
3.1.
MATERIALIEN
21
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
3.1.4.
3.1.5.
3.1.6.
3.1.7.
3.1.8.
3.1.9.
3.1.10.
3.1.11.
VIRUS
UND
ZELLKULTUR
21
NAEHRMEDIEN
21
CHEMIKALIEN
22
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
22
ENZYME
22
NUKLEOTIDE
UND
OLIGONUKLEOTIDE
23
GROESSENSTANDARDS
24
BAKTERIENSTAEMME
UND
VEKTOREN
25
VORGEFERTIGTE
SYSTEME
(KITS)
26
PUFFER
UND
LOESUNGEN
26
SONSTIGE MATERIALIEN
26
3.2.
METHODEN
27
3.2.1.
UNTERSUCHTE
TIERE
UND
VERSUCHSANORDNUNG
27
3.2.2.
METHODEN
ZUR
RNA-GEWINNUNG
27
3.2.2.1.
VIRUSGEWINNUNG
27
3.2.2.2.
PROBENGEWINNUNG
28
3.2.2.3.
EXTRAKTION
DER
RNA
28
3.2.2.4.
RNA-MESSUNG
29
3.2.2.5.
GELELEKTROPHORESE
DER
ISOLIERTEN
RNA
30
3.2.3.
METHODEN
ZUR
CDNA-SYNTHESE
30
3.2.3.1.
PRIMER
30
32.3.2.
RT-PCR
MIT
MMLV
UND
EXPANDYY
HIGH
FIDELITY
PCR
SYSTEM
31
3.2.3.3.
TITANYY
ONE
TUBE
RT-PCR
SYSTEM
32
3.2.3.4.
RT-PCR
(NACH
LABORPROTOKOLL
MCCRAE,
UNIVERSITY
OF
WARWICK,
COVENTRY,
UK)
32
3.2.4.
ANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
32
3.2.4.1.
ANALYTISCHE
AGAROSEGELE
32
3.2.4.2.
SOUTHERN
BLOT
33
3.2.4.3.
HYBRIDISIERUNG
MIT
EINER
BIOTINYLIERTEN
SONDE
33
3.2.4.4.
SPALTUNG
DER
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
34
3.2.5.
METHODEN
ZUR
KLONIERUNG
DER
DNA
34
3.2.5.1.
KLONIERUNG VON
PCR-PRODUKTEN
MIT
T/A
KLONIERUNG
34
3.2.5.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
35
3.2.5.2.1.
PRAEPARATIVE
AGAROSEGELE
35
3.2.5.2.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
(GENE
CLEAN)
36
3.2.5.3.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOREN
36
3.2.5.4.
LIGATION VON
DNA-FRAGMENTEN
36
3.2.5.5.
TRANSFORMATION
VON
E.CO//-ZELLEN
37
3.2.5.5.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
MIT
CACI
2
37
3.2.5.5.2.
TRANSFORMATION
37
3.2.5.6.
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
DNA
38
3.2.5.6.1.
SELEKTION
DURCH
ANTIBIOTIKARESISTENZ
38
3.2.5.6.2.
SELEKTION
DURCH
A-KOMPLEMENTATION
(BLUE-WHITE
SCREENING)
38
3.2.5.6.3.
RESTRIKTIONSANALYSE
DER
PLASMID-DNA
39
3.2.6.
SEQUENZIERUNG
39
3.2.6.1.
SEQUENZIERUNG
MIT
T7-RNA-POLYMERASE
39
3.2.6.2.
GELELEKTROPHORESE
40
3.2.6.3.
AUTORADIOGRAPHIE
41
3.2.7.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
41
3.2.8.
SEROLOGISCHE VERFAHREN
41
3.2.8.1.
LATEX-AGGLUTINATION
42
3.2.8.2.
ELISA
42
3.2.9.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
42
4.
ERGEBNISSE
43
4.1.
VIRUSGEWINNUNG
43
4.2.
ETABLIERUNG
EINER
REVERSEN
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
44
4.2.1.
ISOLIERUNG
VIRALER
RNA
44
4.2.2.
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
44
4.2.2.1.
BESTIMMUNG
DER
PRIMERKONZENTRATION
44
42.2.2.
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
AN
MAGNESIUMCHLORID
45
4.2.2.3.
BESTIMMUNG
DER
ANZAHL
DER
REAKTIONSZYKLEN
46
4.2.2.4.
FESTLEGUNG VON TEMPERATUR-
UND
ZEITPROFIL
47
4.2.3.
EINSATZ
VERSCHIEDENER
ENZYMSYSTEME
48
4.2.4.
EINSATZ
VON
ADDITIVEN
SUBSTANZEN
49
4.2.5.
HYBRIDISIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
51
4.2.6.
RESTRIKTIONSANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
52
4.3.
VERGLEICH
DER
RT-PCR
MIT
KONVENTIONELLEN VERFAHREN
DER
VIRUSDIAQNOSTIK
53
4.3.1.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
53
4.3.2.
SEROLOGISCHE
VERFAHREN
54
4.3.2.1.
ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
54
4.3.2.2.
LATEX-AGGLUTINATION
54
4.3.3.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
55
4.3.4.
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
56
4.3.5.
VERGLEICH
DER
VERSCHIEDENEN
UNTERSUCHUNGSMETHODEN
57
4.4.
KLONIERUNG
DER
AMPLIFIKATE
MIT
T/A
KLONIERUNG
58
4.4.1.
HERSTELLUNG
DES
T/A
VEKTORS
58
4.4.2.
KLONIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
59
4.5.
KOMPETITIVE
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
62
4.5.1.
HERSTELLUNG
DES
KOMPETITOR-FRAGMENTES
62
4.5.2.
KLONIERUNG DES
KOMPETITORS
66
4.5.3.
TRANSKRIPTION
DER
PCR-PRODUKTE
67
4.5.3.1.
LINEARISIERUNG
DER
VEKTOREN
67
4.5.3.2.
TRANSKRIPTION
DER
PLASMID-DNA
67
4.5.4.
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
DER
TRANSKRIBIERTEN
RNA
70
4.5.5.
AMPLIFIKATION
DER
TRANSKRIPTE
DER
EINZELNEN
VERDUENNUNGEN
73
4.5.6.
KOMPETITIVE
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE
KETTENREAKTION
74
4.5.7.
SEQUENZIERUNG
76
4.6.
UNTERSUCHUNGEN
VON
SCHLACHTSCHWEINEN
76
4.7.
NACHWEIS
VON
INHIBITOREN
DER
AMPLIFIKATION
80
5.
DISKUSSION
83
6.
ZUSAMMENFASSUNG
95
6.1.
SUMMARV
97
7.
LITERATURVERZEICHNIS
99
ANHANG
123 |
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