Abbau von Phenol und n-Alkanen durch Acinetobacter calcoaceticus:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1
1.1. MIKROBIELLER PHENOLABBAU 2
1.1.1. VORKOMMEN UND BEDEUTUNG VON PHENOL 4
1.1.2. ENZYME DES PHENOLABBAUS 5
1.2. BAKTERIELLER ALKANABBAU 9
1.2.1. ALKANMONOOXYGENASE 10
1.2.2. ALKOHOL-UND ALDEHYDDEHYDROGENASE 13
1.3. ZIELSTELLUNG ' 15
2. MATERIAL UND METHODEN 17
2.1. CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 17
2.2. STAMMHALTUNG UND KULTIVIERUNG VON
A. CALCOACETICUS 17
2.2.1. BAKTERIEN UND STAMMHALTUNG 17
2.2.2. SUBMERSKULTIVIERUNG 18
2.2.3. LABORFERMENTOR 19
2.2.4. KONTROLLE DES WACHSTUMS - 19
2.3. ZELLAUFSCHLUSS 19
2.3.1. PERMEABILISIERUNG 19
2.3.2. ULTRASCHALL-AUFSCHLUSS 20
2.3.3. ALCOA-AUFSCHLUSS 20
2.3.4. FRENCH PRESS-AUFSCHLUSS 20
2.3.5. GLASPERLEN-AUFSCHLUSS 20
2.4. PRAEPARATION VON ZELLFRAKTIONEN 21
2.5. BESTIMMUNG UND DEFINITION DER ENZYMAKTIVITAETEN 21
2.5.1. PHENOLHYDROXYLASE 21
2.5.2. CATECHOL-L,2-DIOXYGENASE 21
2.5.3. CATECHOL-2,3-DIOXYGENASE 22
2.5.4. SS-KETOADIPAT-SUCCINYL-COA-TRANSFERASE 22
2.5.5 PYRIDINNUKLEOTID-ABHAENGIGE ALKOHOLDEHYDROGENASE 22
2.5.6. PYRIDINNUKLEOTID-UNABLJAENGIGE ALKOHOLDEHYDROGENASE 22
2.5.7. PYRIDINNUKLEOTID-ABHAENGIGE ALDEHYDDEHYDROGENASE 23
2.5.8. PYRIDINNUKLEOTID-UNABHAENGIGE ALDEHYDDEHYDROGENASE 23
2.5.9. ISOCITRATDEHYDROGENASE 23
2.5.10. MALATDEHYDROGENASE 24
2.5.11. NADH-OXIDASE 24
2.5.12. PROTEINBESTIMMUNG 24
2.6. ENZYMATISCHE ETHANOLBESTIMMUNG 24
2.7. NACHWEIS VON CYTROCHROM P450 24
2.8. ELEKTROPHORESEN UND FAERBUNGEN 25
2.8.1. POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE) 25
2.8.1.1. SDSPAGE 25
2.8.1.2. NATIVE PAGE 25
2.8.2. ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 26
2.8.3. FAERBUNG MIT COOMASSIE-BLAU 26
2.8.4. SILBERFAERBUNG 27
2.8.5. AKTIVFAERBUNG NACH NATIVER PAGE 27
2.8.6. KONSERVIERUNG DER GELE 28
2.9. BESTIMMUNG AROMATISCHER SUBSTANZEN MITTELS HPLC 28
2.10. ANREICHERUNG DER PHENOLHYDROXYLASE 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.10.1. AMMONIUMSULFATFALLUNG 29
2.10.2. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 29
2.10.2.1. DEAE-SEPHAROSE FF 30
2.10.2.2. FRACTOGEL EMD DEAE (S) 30
2.10.3. FARBSTOFFLIGAND-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 30
2.10.4. HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE 31
2.10.4.1. FRAKTOGEL TSK-BUTYL 31
2.10.4.2. PHENYL-SEPHAROSE 31
2.10.4.3. OCTYL-SEPHAROSE 31
2.10.5. METALLCHELATAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE ' 31
2.10.6. CARBOXYDECYL-SEPHAROSE 31
2.10.7. HYDROXYLAPATITCHROMATOGRAPHIE 32
2.11. ANREICHERUNG DER NADP
+- ABHAENGIGEN ALKOHOL
DEHYDROGENASE 32
2.11.1. AMMONIUMSULFATFALLUNG 32
2.11.2. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 3 2
2.11.2.1. DEAE-SEPHAROSE FF 32
2.11.3. METALLCHELATAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE - 33
2.12. ANREICHERUNG DER NADP
+-ABHAENGIGEN ALDEHYD
DEHYDROGENASE 33
2.12.1. HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE 3 3
2.12.1.1. PHENYL-SEPHAROSE 33
2.12.2. HYDROXYLAPATITCHROMATOGRAPHIE 33
2.12. GELFILTRATION 33
2.13. BESTIMMUNG DER RELATIVEN MOLMASSE 34
2.13.1. GELFILTRATION 34
2.13.2. SDS-GELELEKTROPHORESE 34
2.14. KONZENTRIERUNG VON PROTEINLOESUNGEN 35
2.15. TROCKENGEWICHTBESTIMMUNG VON ZELLSUSPENSIONEN 35
3. ERGEBNISSE 36
3.1. VERWERTUNG AROMATISCHER VERBINDUNGEN DURCH
A. CALCOACETICUS NCIB 8250 36
3.2. ABBAU VON PHENOL UND PHENOLDERIVATEN DURCH
A. CALCOACETICUS NCIB 8250 37
3.2.1. ABBAU VON PHENOL 3 7
3.2.2. VERWERTUNG VON PHENOLDERIVATEN ALS EINZIGE C- UND ENERGIE
QUELLE UND IM COMETABOLISMUS MIT PHENOL 40
3.3. PHENOLHYDROXY LAESE 42
3.3.1. INDUKTION UND LOKALISATION DER PHENOLHYDROXY LAESE IN
A. CALCOACETICUS NCIB 8250 43
3.3.2. ANREICHERUNG DER PHENOLHYDROXY LAESE 45
3.4. CHARAKTERISIERUNG DER PHENOLHYDROXYLASE AUS
A. CALCOACETICUS NCIB 8250 46
3.4.1. PH-UND TEMPERATUROPTIMUM 46
3.4.2. KINETISCHE PARAMETER 48
3.4.3. SUBSTRATSPEZIFITAET 48
3.4.4. EINFLUSS VON IONEN, SH-REAGENZIEN UND CHELATOREN 49
3.4.5. ENZYMSTABILITAET 51
3.4.6. PERMEABILISIERTE ZELLEN VON
A. CALCOACETICUS NCIB 8250 53
3.5. WACHSTUM VON
A. CALCOACETICUS ADP1 UND DEREN
EMS-MUTANTEN AUF ALIPHATISCHE KOHLENWASSERSTOFFE 53
3.5.1. WACHSTUM VON A. CALCOACETICUS ADP1 M41 AUF HEXADECAN 55
3.5.2. NACHWEIS VON CYTOCHROM P450 55
3.6. VORKOMMEN UND REGULATION NAD(P)
+-ABHAENGIGER UND PYRIDIN
NUKLEOTID-UNABHAENGIGER ALKOHOL- UND ALDEHYDDEHYDROGENASEN 56
3.6.1. ZELLAUFSCHLUSS UND STABILITAET DER NAD(P)+-ABHAENGIGEN ALKO
HOL- UND ALDEHYDDEHYDROGENASEN 56
3.6.2. LOKALISATION DER NAD(P)
+-ABHAENGIGEN ALKOHOL- UND ALDEHYD
DEHYDROGENASEN 57
3.6.3. REGULATION DER NAD(P)
+-ABHAENGIGEN ALKOHOL- UND'ALDEHYD
DEHYDROGENASEN 57
3.7. ANREICHERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER NAD(P)
+-ABHAENGIGEN
ALKOHOLDEHYDROGENASE 61
3.7.1. ANREICHERUNG DER NAD(P)
+-ABHAENGIGEN ALKOHOLDEHYDROGENASE 61
3.7.2. KINETISCHE UND MOLEKULARE PARAMETER 64
3.7.2.1. TEMPERATUR-UND PH-OPTIMUM 64
3.7.2.2. SUBSTRATSPEZIFITAET 65
3.7.2.3. K
M-WERTE - 66
3.7.2.4. EINFLUSS UNTERSCHIEDLICHER VERBINDUNGEN AUF DIE ENZYMAKTIVITAET
67
3.7.2.5. MOLARE MASSE UND ISOELEKTRISCHER PUNKT 69
3.8. ANREICHERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER NAD(P)
+-ABHAENGIGEN
ALDEHYDDEHYDROGENASE 71
3.8.1. ANREICHERUNG DER NAD(P)
+-ABHAENGIGEN ALDEHYDDEHYDROGENASE 71
3.8.2. KINETISCHE UND MOLEKULARE PARAMETER 74
3.8.2.1. TEMPERATUR- UND PH-OPTIMUM 74
3.8.2.2. SUBSTRATSPEZIFITAET 75
3.8.2.3. KM-WERTE 76
3.8.2.4. EINFLUSS UNTERSCHIEDLICHER VERBINDUNGEN AUF DIE AKTIVITAET DER
NADP+-ABHAENGIGEN AIDH I 77
4. DISKUSSION 78
4.1. VERWERTUNG AROMATISCHER VERBINDUNGEN DURCH
A CINETO-
BACTER CALCOACETICUS 78
4.2. METABOLISIERUNG VON PHENOL UND PHENOLDERIVATEN DURCH
ACINETOBACTER CALCOACETICUS 79
4.3. REGULATION DES ABBAUS VON PHENOL 84
4.4. EIGENSCHAFTEN DER PHENOLHYDROXYLASE AUS
ACINETOBACTER
CALCOACETICUS 85
4.5. VERWERTUNG VON ALIPHATISCHEN KOHLENWASSERSTOFFEN DURCH
ACINETOBACTER CALCOACETICUS 89
4.6. REGULATION DER VERWERTUNG VON HEXADECAN IN
ACINETOBACTER
CALCOACETICUS 90
4.7. INITIALER SCHRITT DES N-ALKANABBAUS IN
ACINETOBACTER CALCOA
CETICUS 92
4.8. VORKOMMEN UND MULTIPLIZITAET VON ALKOHOL- UND ALDEHYD
DEHYDROGENASEN IN ACINETOBACTER CALCOACETICUS 92
4.9. KINETISCHE UND MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN DER PYRIDIN
NUKLEOTID-ABHAENGIGEN ALKOHOL- UND ALDEHYDDEHYDROGE
NASEN AUS ACINETOBACTER CALCOACETICUS 93
4.9.1. NAD
+- UND NADP+-ABHAENGIGE ALKOHOLDEHYDROGENASEN 93
4.9.2. NADP+-ABHAENGIGE ALDEHYDDEHYDROGENASE 98
5.
6
.
ZUSAMMENFASSUNG
LITERATURVERZEICHNIS
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