Isolierung und Charakterisierung epithelialer antimikrobieller Proteine des Menschen:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.1
2. MATERIAL UND METHODEN.7
2.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN.7
2.1.1 BEZUGSQUELLEN DER VERWENDETEN CHEMIKALIEN.7
2.1.2 PUFFER UND LOESUNGEN.8
2.1.3 NAEHRMEDIEN. 9
2.2 CHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNGSMETHODEN.9
2.2.1 EXTRAKTION VON PSORIASISSCHUPPEN UND STRATUM COMEUM.9
2.2.2 BAKTERIEN-AFFINITAETSSAEULEN.10
2.2.3 HEPARIN-AFFINITAETSSAEULE.10
2.2.4 CA-UMKEHRPHASEN-HPLC.11
2.2.5 KATIONENAUSTAUSCH-HPLC.11
2.2.6 CIA-UMKEHRPHASEN-HPLC.12
2.2.7 C4-UMKEHRPHASEN-HPLC.R.12
2.3 BESTIMMUNG ANTIMIKROBIELLER AKTIVITAET.13
2.3.1 KULTIVIERUNG DER MIKROORGANISMEN.13
2.3.2 PLATTENDIFFUSIONSTEST.14
2.3.3 FLUESSIGKULTURTEST.14
2.4 ZELLKULTUR.15
2.4.1 HACAT UND A549-ZELLEN.15
2.4.2 PRIMAERE HUMANE EPITHELZELLEN.16
2.4.3 STIMULATION DER ZELLEN.17
2.5 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG ANTIMIKROBIELLER PROTEINE.18
2.5.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).18
2.5.2 WESTEMBLOT.19
2.5.3 FESTPHASEN-ELISA.19
2.5.4 AMINOSAEURESEQUENZANALYSE.20
2.6 SEMIQUANTITATIVE RT-PCR.20
2.6.1 RNA-ISOLIERUNG.20
2.6.2 REVERSE TRANSKRIPTION.21
2.6.3 RT-PCR.22
2.6.4 DENSITOMETRISCHE ANALYSE DER SEMIQUANTITATIVEN RT-PCR.24
2.7 AMPLIFIZIERUNG UNBEKANNTER GENABSCHNITTE.24
2.7.1 3'-RACE-PCR.24
2.7.2 5-RACE-PCR.26
2.7.3 GENOMISCHE AMPLIFIZIERUNG.27
2.8 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN.28
2.9 DNA-SEQUENZIERUNG.30
2.10 CHROMOSOMALE GENLOKALISATION.31
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.11 REKOMBINANTE EXPRESSION.32
2.11.1 STRUKTUR DES EXPRESSIONSVEKTORS.32
2.11.2 DURCHFUEHRUNG DER EXPRESSION.34
2.11.3 AUFREINIGUNG DER EXPRIMIERTEN PROTEINE.35
3. ERGEBNISSE.37
3.1 HBD-2: EIN INDUZIERBARES, SALZEMPFINDLICHES ANTIMIKROBIELLES PEPTID
HUMANER EPITHELIEN.37
3.1.1 HAUT UND GEWEBE DES RESPIRATIONSTRAKTES ZEIGEN ERHOEHTE
HBD-2 MRNA-EXPRESSION.37
3.1.2 KERATINOZYTEN ALS ZELLULAERE QUELLE FUER HBD-2.38
3.1.2.1 STRATUM COMEUM ENTHAELT DAS HUMANE SS-DEFENSIN HBD-2.38
3.1.2.2 DIE HBD-2 MRNA-EXPRESSION IN KERATINOZYTEN IST DURCH
MIKROORGANISMEN INDUZIERBAR.40
3.1.3 RESPIRATORISCHE EPITHELZELLEN PRODUZIEREN HBD-2.41
3.1.3.1 LUNGENEPITHELZELLEN SEZEMIEREN HBD-2.41
3.1.3.2 DIE HBD-2 MRNA-EXPRESSION IN RESPIRATORISCHEN EPITHELZELLEN
WIRD DURCH KONTAKT MIT
PSEUDOMONAS AERUGINOSA STIMULIERT.43
3.1.3.3 TNF-A, IL-1 SS, ABER NICHT IL-6 INDUZIEREN DIE-HBD-2
MRNA-EXPRESSION IN RESPIRATORISCHEN EPITHELZELLEN.46
3.1.3.4 HBD-2 MRNA IST IN VIELEN GEWEBEN DES RESPIRATIONSTRAKTES
NACHWEISBAR.47
3.1.4 DIE ANTIMIKROBIELLE AKTIVITAET VON HBD-2 IST SALZEMPFINDLICH.48
3.1.5 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES HBD-2 GENS.49
3.1.5.1 DAS HBD-2 GEN BESTEHT AUS ZWEI EXONS.49
3.1.5.2 DIE PROMOTOR-REGION DES HBD-2 GENS BEINHALTET EINE VIELZAHL
POTENTIELLER BINDUNGSSTELLEN FUER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN.50
3.1.5.3 DAS HBD-2 GEN IST AUF CHROMOSOM 8P22-23.1 LOKALISIERT.52
3.1.6 FUNKTIONELL AKTIVES HBD-2 LAESST SICH IN E.COLI HERSTEILEN.53
3.2 ENTDECKUNG EINES NEUEN HUMANEN SS-DEFENSINS: HBD-3.55
3.2.1 HERKUNFT UND MOLEKULARE STRUKTUR.55
3.2.1.1 AUS PSORIASISSCHUPPEN LAESST SICH EIN NEUES, KLEINES,
KATIONISCHES ANTIMIKROBIELLES PEPTID AUFREINIGEN.55
3.2.1.2 AMINOSAEURESEQUENZ UND CDNA-SEQUENZ IDENTIFIZIEREN HBD-3 ALS
EIN NEUES MITGLIED DER SS-DEFENSIN-FAMILIE.57
3.2.2 HBD-3 BESITZT HOHE ANTIMIKROBIELLE AKTIVITAET.59
3.2.3 HBD-3 MRNA-EXPRESSION.60
3.2.3.1 NIEDRIGE HBD-3 MRNA-EXPRESSION IST IN VIELEN GEWEBEN
NACHWEISBAR.60
3.2.3.2 DIE HBD-3 MRNA-EXPRESSION IN KERATINOZYTEN IST INDUZIERBAR.61
3.2.4 FUNKTIONELL AKTIVES HBD-3 LAESST SICH IN
E.COLI HERSTELLEN.63
3.3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES NEUEN ANTIMIKROBIELLEN
PROTEINS MIT RNASE-AKTIVITAET: RNASE 7.64
3.3.1 HERKUNFT UND STRUKTUR.64
3.3.1.1 AUFREINIGUNG EINES NEUEN ANTIMIKROBIELLEN PROTEINS AUS
PSORIASISSCHUPPEN.64
3.3.1.2 RNASE 7 LAESST SICH AUCH AUS STRATUM CORNEUM ISOLIEREN.65
3.3.1.3 DIE ANALYSE DER CDNA-SEQUENZ VON RNASE 7 IDENTIFIZIERTE
DIESES ANTIMIKROBIELLE PROTEIN ALS MITGLIED DER RNASE-FAMILIE.65
3.3.2 RNASE 7 BESITZT EIN WEITES SPEKTRUM AN ANTIMIKROBIELLER
AKTIVITAET.67
3.3.3 HOHE RNASE-AKTIVITAET BESTAETIGT DIE ZUGEHOERIGKEIT VON RNASE 7
ZUR RNASE-FAMILIE.68
3.3.4 RNASE 7 MRNA-EXPRESSION.69
3.3.4.1 RNASE 7 MRNA-EXPRESSION IST NICHT NUR IN DER HAUT ZU
DETEKTIEREN.69
3.3.4.2 DIE RNASE 7 MRNA-EXPRESSION IN KERATINOZYTEN IST INDUZIERBAR.70
3.4 KERATINOZYTEN EXPRIMIEREN LYSOZYM.72
3.4.1 HACAT-ZELLEN SEZEMIEREN LYSOZYM ALS EIN DOMINANTES
ANTIMIKROBIELLES PROTEIN.72
3.4.2 LYSOZYM MRNA WIRD IN PRIMAEREN KERATINOZYTEN EXPRIMIERT.75
3.5 EPITHELIEN EXPRIMIEREN DAS A-DEFENSIN HNP-1.75
3.5.1 STRATUM COMEUM ENTHAELT DAS HUMANE A-DEFENSIN HNP-1.75
3.5.2 KERATINOZYTEN UND A 549-LUNGENEPITHELZELLEN SEZEMIEREN HNP-1.77
3.5.3 HNP-1/-3 MRNA IST IN KERATINOZYTEN NACHWEISBAR.77
4. DISKUSSION.79
4.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG ZWEIER NEUER HUMANER SS-DEFENSINE:
HBD-2 UND HBD-3. 79
4.1.1 HBD-2: EIN INDUZIERBARES ANTIMIKROBIELLES PROTEIN DER HAUT
UND RESPIRATORISCHER EPITHELIEN.79
4.1.2 ENTDECKUNG EINES NEUEN HUMANEN SS-DEFENSINS: HBD-3.87
4.1.3 REKOMBINANTES HBD-2 UND HBD-3 KOENNEN IN E.COLI PRODUZIERT
WERDEN.89
4.2 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES NEUEN HUMANEN
ANTIMIKROBIELLEN PROTEINS MIT RNASE-AKTIVITAET: RNASE 7.91
4.3 EPITHELZELLEN ALS PRODUZENTEN HUMANER A-DEFENSINE.93
4.4 LYSOZYM: EIN ANTIMIKROBIELLES PROTEIN DER KERATINOZYTEN.96
4.5 BEDEUTUNG ANTIMIKROBIELLER PROTEINE FUER DIE ANGEBORENE IMMUNITAET
HUMANER EPITHELIEN.98
4.6 AUSBLICK.101
5. ZUSAMMENFASSUNG.103
6. LITERATURVERZEICHNIS.105
7. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.115
8. DANKSAGUNG.117
9. LEBENSLAUF.118
10. ERKLAERUNG. 119 |
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