Untersuchungen zur Vitrifikation immaturer und in vitro gereifter Rinderoozyten mit der "Minimal-drop-size"-Technik unter Verwendung verschiedener Kryoprotektiva-Kombinationen:
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1
EINLEITUNG
.
1
2
LITERATUROBERSICHT
.
4
2.1
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
RINDEREMBRYONEN
.
4
2.1.1
OOZYTENGEWINNUNG
.
4
2.1.1.1
GEWINNUNG
VON
OOZYTEN
.
4
2.1.1.2
OOZYTENSELEKTION
.
5
2.1.2
IN-VITRO-MATURATION
DER
OOZYTEN
.
6
2.1.2.1
REIFUNGSMEDIEN
UND-ZUSAETZE
.
7
2.1.2.1.1
HORMONE
.
7
2.1.2.1.2
SERUM
UND
SERUMERSATZSTOFFE
.
8
2.1.2.1.3
ANDERE
ZUSAETZE
.
9
2.1.3
IN-VITRO-FERTILISATION
.
10
2.1.3.1
BEHANDLUNG
DES
SPERMAS
.
12
2.1.3.1.1
SPERMAAUFBEREITUNG
.
12
2.1.3.1.2
KAPAZITATION
.
12
2.1.3.2
KOKULTUR
VON
OOZYTEN
UND
SPERMIEN
.
13
2.1.4
IN-VITRO-KULTIVIERUNG
BEFRUCHTETER
OOZYTEN
.
15
2.1.4.1
MEDIEN
.
15
2.1.4.2
MEDIENZUSAETZE
.
21
2.1.5
AEUSSERE
KULTURBEDINGUNGEN
RJR
DIE
IN-VITRO-PRODUKTION
VON
EMBRYONEN
.
22
2.2
KRYOKONSERVIERUNG
.
25
2.2.1
KRYOPROTEKTIVA
.
26
2.2.1.1
PENETRIERENDE
KRYOPROTEKTIVA
.
26
2.2.1.1.1
GLYCERIN
.
28
2.2.1.1.2
DIMETHYLSULFOXID
.
29
2.2.1.1.3
ETHYLENGLYKOL
.
29
2.2.1.1.4
1
,2-PROPANDIOI
.
30
2.2.1.1.5
BUTANDIOL
.
31
2.2.1.1.6
WEITERE
MOEGLICHKEITEN
ZUM
GEFRIERSCHUTZ
MIT
PENETRIERENDEN
KRYOPROTEKTIVA
.
32
2.2.1.2
NICHT-PENETRIERENDE
KRYOPROTEKTIVA
.
32
2.2.2
ABLAUF
DER
KRYOKONSERVIERUNG
.
34
2.2.2.1
AEQUILIBRIERUNG
.
34
2.2.2.2
GEFRIERVERFAHREN
.
35
2.2.2.2.1
KONTROLLIERTE
TIEFGEFRIERVERFAHREN
.
36
2.2.2.2.2
ULTRASCHNELLES
TIEFGEFRIEREN
.
,
.
38
2.2.2.2.3
VITRIFIKATION
.
39
2.2.2.3
AUFTAUVERFAHREN
.
40
2.2.2.4
ENTFERNUNG
DER
KRYOPROTEKTIVA
.
41
2.2.2.5
VERWENDUNG
VON
GEFRIERBEHAELTEM
ZUR
KRYOKONSERVIERUNG
.
43
2.2.3
GEFRIERSCHAEDEN
.
44
2.2.4
KRYOKONSERVIERUNG
VON
OOZYTEN
.
47
2.2.4.1
KRYOKONSERVIERUNG
VON
RINDEROOZYTEN
.
48
2.2.4.2
KRYOKONSERVIERUNG
VON
OOZYTEN
VERSCHIEDENER
SPEZIES
.
54
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
65
3.1
GEWINNUNG
VON
KUMULUS-OOZYTEN-KOMPLEXEN
UND
DEREN
SELEKTION
.
65
3.2
IN-VITRO-MATURATION
.
66
3.3
IN-VITRO-FERTILISATION
.
67
3.3.1
VORBEREITUNG
DER
SPERMIEN
.
.;
.
67
3.3.2
VORBEREITUNG
DER
KOK
.
68
3.4
IN-VITRO-KULTUR
.
68
3.5
KRYOKONSERVIERUNGSMETHODEN
.
71
3.5.1
KRYOKONSERVIERUNG
AUF
"ELECTRON
MICROSCOPE
COPPER
GRIDS
"
.
71
3.5.2
KRYOKONSERVIERUNG
IN
"OPEN
PULLED
STRAWS"
.
71
3.6
VERSUCHE
ZUR
ERMITTLUNG
DER
TOXIZITAET
DER
VERWENDETEN
KRYOPROTEKTIVA
KOMBINATIONEN
.
74
3.7
VERSUCHE
ZUR
VITRIFIKATION
VON
OOZYTEN
.
75
3.7.1
VITRIFIKATIONSVERSUCHE
MIT
EMC-GRIDS
.
75
3.7.1.1
VITRIFIKATION
IN
22,5%
GLYCERIN,
22,5%
PROPANDIOL
(4
STUFEN:
12,5;
25;
50;
100%)
UND
AUSVERDUENNUNG
IN
2
STUFEN
.
75
3.7.1.2
VITRIFIKATION
IN
25%
GLYCERIN,
25%
PROPANDIOL
UND
AUSVERDUENNUNG
IN
2
STUFEN
.
75
3.7.1.3
VITRIFIKATION
IN
10%
GLYCERIN,
20%
PROPANDIOL
UND
AUSVERDUENNUNG
IN
2
STUFEN
.
76
3.7.1.4
VITRIFIKATION
IN
20%
ETHYLENGLYKOL,
20%
DIMETHYLSULFOXID,
10%
BUTANDIOL
UND
AUSVERDUENNUNG
IN
2
STUFEN
.
76
3.7.1.5
VITRIFIKATION
IN
20%
ETHYLENGLYKOL,
20%
BUTANDIOL,
0,5
M
SUCROSE
UND
AUSVERDUENNUNG
IN
2
STUFEN
.
77
3.7.2
VITRIFIKATIONSVERSUCH
MIT
OPS
IN
20%
ETHYLENGLYKOL,
20%
BUTANDIOL,
0,5
M
SUCROSE
UND
AUSVERDUENNUNG
IN
2
STUFEN
.
78
3.8
VITALITAETSBEURTEILUNG
.
79
3.8.1
ACETO-LACMOID-FAERBUNG
.
79
3.8.2
FAERBUNG
DER
EMBRYONEN
MIT
HOECHSTFARBSTOFF
NR.
33342
.
79
3.8.3
ENTWICKLUNG
NACH
IVF
.
80
3.8.4
EMBRYOTRANSFERS
.
80
3.9
STATISTISCHE
AUSWERTUNGEN
.
81
3.10
SCHEMATISCHER
VERSUCHSAUFBAU
.
81
4
ERGEBNISSE
.
85
4.1
VERIFIKATION
IMMATURCR
UND
IN
VITRO
GEREIFTER
RINDEROOZYTEN
MIT
FUENF
VERSCHIEDENEN
KRYOPROTEKTIVA-KOMBINATIONEN
UND
ZWEI
VERSCHIEDENEN
GEFRIERBEHAELTERN
.
86
4.1.1
VERSUCH
1:
VITRIFIKATION
VON
RINDEROOZYTEN
IN
22,5%
GLYCERIN
+
22,5%
PROPANDIOL
.
86
4.1.1.1
IMMATURE
OOZYTEN
.
86
4.1.1.2
IN
VITRO
GEREIFTE
OOZYTEN
.
86
4.1.2
VERSUCH
2:
VITRIFIKATION
VON
RINDEROOZYTEN
IN
25%
GLYCERIN
+
25%
PROPANDIOL
.
89
4.1.2.1
IMMATURE
OOZYTEN
.
89
4.1.2.2
IN
VITRO
GEREIFTE
OOZYTEN
.
89
4.1.3
VERSUCH
3:
VITRIFIKATION
VON
RINDEROOZYTEN
IN
10%
GLYCERIN
+
20%
PROPANDIOL
.
92
4.1.3.1
IMMATURE
OOZYTEN
.
92
4.1.3.2
IN
VITRO
GEREIFTE
OOZYTEN
.
92
4.1.4
VERSUCH
4:
VITRIFIKATION
VON
RINDEROOZYTEN
IN
20%
ETHYLENGLYKOL
+
20%
DIMETHYLSULFOXID
+
10%
BUTANDIOL
.
95
4.1.4.1
IMMATURE
OOZYTEN
.
95
4.1.4.2
IN
VITRO
GEREIFTE
OOZYTEN
.
95
4.1.5
VERSUCH
5:
VITRIFIKATION
VON
RINDEROOZYTEN
IN
20%
EG
+
20%
BUTANDIOL
+
0,5
M
SUCROSE
.
98
4.1.5.1
IMMATURE
OOZYTEN
.
98
4.1.5.2
IN
VITRO
GEREIFTE
OOZYTEN
.
98
4.1.6
VERSUCH
6:
VITRIFIKATION
IN
VITRO
GEREIFTER
RINDEROOZYTEN
IN
20%
ETHYLENGLYKOL
+
20%
BUTANDIOL
+
0,5
M
SUCROSE
MIT
OPS
ALS
GEFRIERBEHAELTER
.
101
4.2
UEBERGREIFENDE
BETRACHTUNG
DER
ERGEBNISSE
.
103
4.2.1
ACETO-LACMOID-FAERBUNG
NACH
IN-VITRO-MATURATION
UND
NACH
IN-VITRO-FERTILISATION
.
103
4.2.1.1
MATURATIONSKONTROLLE
NACH
VITRIFIKATION
IMMATURER
OOZYTEN
.
103
4.2.1.2
FERTILISATIONSKONTROLLE
NACH
VITRIFIKATION
IMMATURER
OOZYTEN
.
104
4.2.1.3
FERTILISATIONSKONTROLLE
NACH
VITRIFIKATION
IN
VITRO
GEREIFTER
OOZYTEN
.104
4.2.2
ERGEBNISSE
DER
LN-VITRO-K.ULTUR
.
105
4.2.2.1
TOXIZITAETSVERSUCHE
.
105
4.2.2.1.1
FURCHUNGSRATEN
.105
4.2.2.1.2
ENTWICKLUNGSRATEN
.108
4.2.2.2
VITRIFIKATIONSVERSUCHE
.110
4.2.2.2.1
FURCHUNGSRATEN
.
110
4.2.2.2.2
ENTWICKLUNGSRATEN
.
.
112
4.3
GESAMTZELLZAHLEN
.114
4.4
EMBRYOTRANSFERS
.
114
5
DISKUSSION
.
118
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
127
7
SUMMARY
.132
8
ANHANG
.
137
8.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.137
8.2
MEDIEN
.139
8.2.1
FERTILISATIONSMEDIEN
.
139
8.2.2
KULTURMEDIUM
SOF
.140
8.3
TABELLENANHANG
.
141
9
LITERATURVERZEICHNIS
.
151 |
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