Untersuchungen zur Biotransformation und Toxizität mit der Hepatomzellinie Hep G2 im Vergleich zu Primärkulturen der Wisterratte:
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1999
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1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG.
1
2 CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN IN-VITRO-TESTSYSTEME.8
2.1 DIE ZELLKULTUREN.
3
2.1.1 DIE HEP G2-KULTUR.8
2.1.1.1 MORPHOLOGIE.8
2.1.1.2 KULTIVIERUNG.
10
2.1.2 DIE HEPATOZYTENKULTUR.
13
2.1.2.1 ISOLATION DER HEPATOZYTEN.
14
2.1.2.2 KULTIVIERUNG.
18
2.1.3 DIE LYMPHOZYTENKULTUR.
17
2.1.3.1 ISOLATION.
18
2.1.3.2 KULTIVIERUNG.
19
2.2
SUBZELLULAERE FRAKTIONEN.
20
2.3 FREMDSTOFFMETABOLISCHE CHARAKTERISIERUNG.
22
2.3
.1
7-ETHOXYRESORUFIN-O-DEETHYLIERUNG.23
2.3.1.1 7-ETHOXYRESORUFIN-O-DEETHYLIERUNG DURCH HEP G
2
- UND
RATTENHEPATOZYTENKULTUREN.24
2.3.1.2 7-ETHOXYRESORUFIN-O-DEETHYLIERUNG IN ZELLHOMOGENATEN UND IN
SUBZELLULAEREN FRAKTIONEN.28
2.3.1.3 7-ETHOXYRESORUFIN-O-DEETHYLIERUNG DURCH
RATTENLYMPHOZYTENKULTUREN.29
2.3.2 7-ETHOXYCOUMARIN-O-DEETHYLIERUNG.
30
2.3.2.1 7-ETHOXYCOUMARIN-O-DEETHYLIERUNG DURCH HEP G2- UND
RATTENHEPATOZYTENKULTUREN.
31
2.3.2 2 7-ETHOXYCOUMARIN-O-DEETHYLIERUNG DURCH ZELLHOMOGENATE UND
SUBZELLULAERE FRAKTIONEN.
33
2.3.3 AMINOPHENAZON-N-DEMETHYLIERUNG.
34
2.3.3.1 AMINOPHENAZON-N-DEMETHYLIERUNG DURCH HEP G2- UND
RATTENHEPATOZYTENKULTUREN.
35
2.3.3 2 AMINOPHENAZON-N-DEMETHYLIERUNG DURCH ZELLHOMOGENATE UND
ISOLIERTE ZELLORGANELLEN.36
2.3.4 4-(N,N-DIMETHYLAMINO)AZOBENZEN-REDUKTION.
37
2.3.4
.1
4-(N,N-DIMETHYLAMINO)AZOBENZEN-REDUKTION DURCH HEP G2- UND
RATTENHEPATOZYTENKULTUREN.
39
2.3.4 2 4-(N,N-DIMETHYLAMINO)AZOBENZEN-REDUKTION DURCH ZELLHOMOGENATE
UND
SUBZELLUIAERE FRAKTIONEN.40
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/958602921
2.3.4 3 4-(N,N-DIMETHYLAMINO)AZOBENZERVREDUKTION DURCH
RATTENLYMPHOZYTENKULTUREN .41
2.3.5 P-NITROPHENOL-KONJUGATION.42
2.3.5.1 P-NITROPHENOTKONJUGATION DURCH HEP G2- UND
RATTENHEPATOZYTENKULTUREN.44
2 3.5.2 P-NITROPHENOLKONJUGATION IN ZELLHOMOGENATEN UND SUBZELLULAEREN
FRAKTIONEN.45
3 UNTERSUCHUNGEN ZUR BIOTRANSFORMATION VON 3 POTENTIELLEN.
ARZNEISTOFFEN DURCH HEP G2-ZEUEEN
3.1
3.1.1
3.1.2
AWD 100-041
AUFKLAERUNG DER DURCH HEP G2-KULTUREN GEBILDETEN METABOLITEN.
VERGLEICH DES METABOLITENSPEKTRUMS VON HEP G2-ZELTEN MIT VERSUCHEN
AN DER WISTAR-RATTE.
3.2 AR 12463.
3.2.1 AUFKLAERUNG DER DURCH HEP G2-KULTUREN GEBILDETEN METABOLITEN.
3.2 2 VERGLEICH DES METABOLITENSPEKTRUMS VON HEP G2-ZELLEN MIT VERSUCHEN
AN DER WISTAR-RATTE.
3.3 FLM5011.
3.3.1 AUFKLAERUNG DER DURCH HEP G2-KULTUREN GEBILDETEN METABOLITEN.
3.3.2 VERGLEICH DES METABOLITENSPEKTRUMS VON HEP G2-ZELLEN MIT VERSUCHEN
AN DER WISTAR-RATTE.
4 ZYTOTOXIZITAETS- UND PROLIFERATIONSUNTERSUCHUNGEN MIT HILFE VON
HEP G2-ZELTEN.
4.1 PROLIFERATION UND ZYTOTOXIZITAET.
4.1.1 DIE T ESTSYSTEME.
4.1.1.1 DER LDH TEST.
4.1.1.2 BESTIMMUNG DES DNA-GEHALTS MIT BISBENZIMID.
4.1.1.3 BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTS MIT AMIDOSCHWARZ
4.1.2 DIE TESTSUBSTANZEN.
4.1.2.1 AWD 100-041.
4.1.2.2 AR 12463.
4.1.2.3 FLM5011.
4.1.2.4 SOLANUM LYCOPERSICON.
4.1.2.5 3-METHYLCHOLANTHREN.
4.1.2.6 PHENOBARBITAL.
4.1.2.7 CLOFIBRAT.
4.1.2.8 DMSO.
4.1.2.9 VERGLEICH VON DMSO MIT ANDEREN LOESUNGSMITTELN.
48
48
49
51
53
53
56
57
58
61
64
64
64
64
66
66
67
68
69
71
73
77
79
80
82
83
II
4.1.2.10 7-ETHOXYRESORUFIN.
4.2 APOPTOSE.
4.2.1 ERKENNEN VON APOPTOSE.
4.2.2 NACHWEIS VON APOPTOTISCHEN VORGAENGEN NACH INKUBATION MIT FLM
5011.
5 DISKUSSION UND ZUSAMMENFASSUNG-
6 EXPERIMENTELLER TEIL.
SS.1 GERAETE.-.
6.2 SUBSTANZEN UND KULTURZUBEHOER.
6.3 ZELLKULTUREN UND VERSUCHSTIERE.
6.4 STERILISATION.
6.5 KULTIVIERUNG DER HEP G2-ZEUEEN.
6.5.1 MEDIUM UND KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN.
6.5.2 KULTIVIERUNG AN CYTODEX.
6.6 KULTIVIERUNG DER HEPATOZYTEN.
6.6.1 ISOLATION.
6.6.2 MEDIUM UND KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN.
6.7 KULTIVIERUNG DER LYMPHOZYTEN.
6.7.1 ISOLATION.
6.7.2 MEDIUM UND KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN.
6.8 MODELLREAKTIONEN.
6.8.1 7-ETHOXYRESORUFIN-O-DEETHYLIERUNG.
6.8.2 7-ETHOXYCOUMARIN-O-DEETHYLIERUNG.
6.8.3 AMINOPHENAZON-N-DEMETHYLIERUNG.
6.8.4 4-(N,N-DIMETHYLAMINO)AZOBENZEN-REDUKTION.
6.8.5 P-NITROPHENOL-KONJUGATION.
6.8.6 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAETEN IN ULTRASCHALL-BEHANDELTEN
ZELLKULTUREN
6.8.7 BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITAETEN IN ISOLIERTEN ZEIIORGANELLEN VON
HEP G2-ZELLEN.
6.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG.
6.10 BIOTRANSFORMATION VON POTENTIELLEN ARZNEISTOFFEN.
6.10.1 AWD 100-041.
6.10.1.1 GEWINNUNG DER METABOLITEN.
6.10.1.2 ISOLATION UND IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS HPLC.
6.10.1.3 IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS DC.
6.10.1.4 IDENTIFIZIERUNG DER METABOLITEN MITTELS MS.
.84
.85
.87
.88
.94
104
104
104
105
105
105
106
107
.108
108
.110
110
.110
111
.111
.111
.112
.112
.113
.113
.114
.114
.116
.116
.116
.116
.116
.117
.117
III
6.10.2 AR 12463.117
6 10.2.1 GEWINNUNG DER METABOLITEN.
117
6.10.2.2 ISOLATION UND IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS HPLC.118
6.10.2.3 IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS DC.118
6.10.2.4 IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS VON GC/MS.118
6.10.3 FLM5011.119
6.10.3.1 GEWINNUNG DER METABOLITEN.
119
6.10.3.2 ISOLATION UND IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS HPLC.119
6.10.3.3 IDENTIFIKATION DER METABOLITEN MITTELS DC.119
6.10.3.4 IDENTIFIZIERUNG DER METABOLITEN MITTELS MS.119
6.10.3.5 BESTIMMUNG DER UMSATZRATE.120
6.11 ZYTOTOXIZITAETSBESTIMMUNGEN.120
6.11.1 DER AMIDOSCHWARZTEST.120
6.11.2 DER LDH TEST.
121
6.11.3 BESTIMMUNG DER ZYTOTOXIZITAET DURCH QUANTIFIZIEREN DES
DNA-GEHALTS.121
6.12 NACHWEISMETHODEN FUER APOPTOSE.122
6.12.1 DNA-LEITER.122
6.12.2 ANFAERBEN VON APOPTOTISCHEN ZELLEN MIT ANNEXIN-V-BIOTIN.123
6.12.3 APOALERT FLICE ASSAY VON CLONTECH LABORATORIES.124
7 LITERATUR.125
IV |
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