Identifizierung und Charakterisierung neuer Varianten der murinen Kinase G-Protein-gekoppelter Rezeptoren: GRK6
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.3
1 EINLEITUNG.5
1.1 ALLGEMEINE EINFUEHRUNG. 5
1.2 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN.5
1.3 G-PROTEINE.8
1.4 G-PROTEIN-AKTIVIERUNG.9
1.5 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTORKINASEN.10
1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT. 13
2 MATERIAL. 15
2.1 CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN.15
2.2 ENZYME, NUKLEINSAEUREN UND ENTSPRECHENDE PUFFER. 16
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE KITS.16
2.4 PLASMIDE.^7
2.5 PRIMER.
17
2.5.1 5 '-SENSE-PRIMER GRK6, KLONE B UND D
.17
2.5.2 5 '-SENSE-PRIMER GRK6, SPEZIFISCH FUER KLON B
.17
2.5.3 5 '-SENSE-PRIMER GRK6, SPEZIFISCH FUER KLON D
. 17
2.5.4 3 '-ANTISENSE-PRIMER GRK6, KLONE B UND D
.18
2.5.5 3 -ANLISENSE-PRIMER GRK6, SPEZIFISCH FUER KLON B
.18
2.5.6 3 -ANTISENSE-PRIMER GRK6, SPEZIFISCH FUER KLON D
.18
2.5.7 AUSSCHLIESSLICH FUER GENOMISCHE ANALYSE VERWENDETE PRIMER
.18
2.5.8 PRIMER FUER DIE IDENTIFIZIERUNG UNBEKANNTER REZEPTORKINASEN
.19
2.5.9 PLASMID- UND OLIGO-DT-PRIMER
.19
2.6 RADIOAKTIV MARKIERTE CHEMIKALIEN.19
2.7 ZELLSTAEMME UND PHAGEN.*9
2.8 GERAETE.^
2.9 ALLGEMEIN VERWENDETE PUFFER UND LOESUNGEN.20
2.10 NAEHRMEDIEN ZUR BAKTERIENANZUCHT.21
3 METHODEN.
23
3.1 ARBEITEN MIT NUKLEINSAEUREN.
23
3.1.1 FAELLEN VON NUKLEINSAEUREN AUS WAESSRIGEN LOESUNGEN
.23
3.1.2 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN
.23
3.1.3 DNA-ISOLIERUNG AUS MAUSGEWEBE.
. 24
3.1.4 GESAMT-RNA -ISOLIERUNG AUS MAUSGEWEBE
.24
3.1.5 ISOLIERUNG VON POLY(A)-RNA AUS GESAMT-RNA
. 25
3.1.6 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENMMG VON DNA IN AGAROSEGELEN
.26
3.1.7 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN
.26
3.1.8 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.27
3.1.9 REVERSE TRANSKRIPTION - CDNA-SYNTHESE
. 27
3.1.10 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR)
.28
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2 KLONIERUNG UND ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA.29
3.2.1 VEKTORPRAEPARATION. 29
3.2.2 PRAEPARATION DER INSERT-DNA VOR DER LIGATION.30
3.2.3 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN IN VEKTOREN.30
3.2.4 PRAEPARATION KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN.31
3.2.5 TRANSFORMATION VON LIGATIONSPRODUKTEN IN KOMPETENTE BAKTERIEN.32
3.2.6 ISOLIERUNG KLEINER MENGEN VON PLASMID-DNA (MINIPRAEPARATION).32
3.2.7 PRAEPARATION GROESSERER MENGEN VON PLASMID-DNA (MEDIPRAEPARATION).33
3.3 BLOTVERFAHREN UND HYBRIDISIERUNG.33
3.3.1 TRANSFER UND BINDUNG VON NUKLEINSAEUREN AUF NYLONMEMBRANEN
.33
3.3.2 HERSTELLUNG VON PCR BLOTS.34
3.3.3 HERSTELLUNG VON SOUTHERN BLOTS
.34
3.3.4 HERSTELLUNG VON NORTHERN BLOTS.35
3.3.5 PRAEPARATION EINES PLASMID-LNSERTS FUER HYBRIDISIERUNGEN.36
3.3.6 IN VITRO-MARKIERUNG VON DNA-SONDEN.37
3.3.7 HYBRIDISIERUNG (PCR-, SOUTHERN-, NORTHERN BLOT). 37
3.3.8 A UTORADIOGRAPHIE.38
3.4 SEQUENZIEREN VON DNA.39
3.4.1 SEQUENZIERREAKTION FUER DOPPELSTRAENGIGE DNA
. 3 9
3.4.2 A UFTRENNEN DER SEQUENZIERTEN DNA AUF POLYACRYLAMIDGELEN.40
3.5 SCREENING EINER LAMBDA ZAP CDNA-BANK.41
3.5.1 FIRST SCREENING.41
3.5.2 SECOND SCREENING
.42
4 ERGEBNISSE.44
4.1 SCREENING EINER THYMUS-CDNA-BANK MIT GRK6-SONDE.44
4.2 SEQUENZANALYSE DER GRK6 CDNAS AUS DER CDNA-BANK.45
4.2.1 MGRK6-B. 45
4.2.2 MGRK6-D
.50
4.3 IDENTIFIZIERUNG WEITERER GRK6-CODIERENDER CDNAS.54
4.3.1 IDENTIFIZIERUNG DES HUMANEN HOMOLOGS VON GRK6: MGRK6-C.54
4.3.2 IDENTIFIZIERUNG DER CDNA MGRK6-A.56
4.4 UEBERSICHT DER CDNAS MGRKOE-A, -B , -C, -D UND VERGLEICH
MIT IHREM HUMANEN HOMOLOG.60
4.5 SOUTHERN BLOT-ANALYSE.63
4.6 NORTHERN BLOT-ANALYSE.64
4.7 VERSUCHE ZUR ISOLIERUNG WEITERER REZEPTORKINASEN.65
4.7.1 PCR MIT UNSPEZIFISCHEN (DEGENERIERTEN) PRIMERN
.65
4.7.2 PCR MIT OLIGO-DT-PRIMER. 67
5 DISKUSSION.68
6 ZUSAMMENFASSUNG.77
7 LITERATUR.79
DANKSAGUNG.90
LEBENSLAUF.91
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