Entwicklung eines gentherapeutischen Transportsystems auf der Basis von rekombinanten JC-virusähnlichen Partikeln:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Göttingen
Cuvillier
2000
|
| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Göttingen, Univ., Diss., 1999 |
| Beschreibung: | VIII, 148 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
| ISBN: | 3897128063 |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
SOMATISCHE
GENTHERAPIE
1
1.1.1.
GENTHERAPEUTISCHE
BEHANDLUNGSMETHODEN
2
1.1.2.
TRANSPORTSYSTEME
FUER
DIE
GENTHERAPIE
3
1.1.2.1.
VIRALE
TRANSPORTSYSTEME
FUER
DIE
GENTHERAPIE
4
1.1.2.2.
NICHT-VIRALE
TRANSPORTSYSTEME
FUER
DIE
GENTHERAPIE
5
1.2.
DAS
HUMANE
POLYOMAVIRUS
JCV
7
1.2.1.
GENOMSTRUKTUR
DES
JC
VIRUS
8
1.2.2.
MORPHOLOGIE
DES
JC
VIRUS
10
1.2.3.
INFEKTIONSZYKLUS
UND
REZEPTORSPEZIFITAET
DES
JC
VIRUS
11
1.2.4.
JC
VIRUS
ALS
ETIOLOGISCHES
AGENS
DER
PROGRESSIVEN
MULTIFOKALEN
LEUKOENZEPHALOPATHIE
13
1.2.5.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
VPL-VLPS
DES
HUMANEN
JC
VIRUS
IN
INSEKTENZELLEN
14
13.
ALTERNATIVES
MODELL
ZU
BISHERIGEN
GENTHERAPEUTISCHEN
TRANSPORTSYSTEMEN
16
2.
AUFGABENSTELLUNG
18
3.
MATERIAL
19
3.1.
CHEMIKALIEN
19
3.2.
PUFFER
UND
MEDIEN
19
33.
E.COZI-STAEMME
20
3.4.
ZELLINIEN
20
3.5.
VIREN
21
3.6.
VEKTOREN
22
3.7.
OLIGONUKLEOTIDE
22
3.8.
ANTISERUM
UND
ANTIKOERPER
23
3.9.
MOLEKULARE
VERGLEICHSSTANDARDS
23
3.10.
COMPUTER-SOFTWARE
24
4.
METHODEN
25
4.1.
KULTIVIERUNG
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
25
4.2.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
26
4.2.1.
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
26
4.2.2.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
26
4.2.3.
COOMASSIE
BRILLIANT-BLUE-FAERBUNG
VON
SDS-PAGE-GELEN
27
4.2.4.
WESTERN
BLOT
27
4.2.5.
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
28
4.2.6.
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
29
4.2.7.
HAEMALAUNFAERBUNG
VON
ZELLKERNEN
29
4.2.8.
NACHWEIS
DER
DNA-EINSCHLEUSUNG
UND
EXPRESSION
MIT
HILFE
DES
SS-GALAKTOSIDASE-TESTS
30
4.2.9.
BESTIMMUNG
DER
EXPRESSIONSSTAERKE
MIT
HILFE
DES
LUZIFERASE-TESTS
30
4.2.10.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
PROTEINEN
31
43.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
32
4.4.
HAEMAGGLUTINATIONSTEST
32
4.5.
EXPRESSION VON
JCV-PARTIKELN
IN
SVG-ZELLEN
33
4.6.
EXPRESSION
VIRALER
PROTEINE
IN
INSEKTENZELLEN
33
4.6.1.
HERSTELLUNG
EINES
REKOMBINANTEN
VPL-BAKULOVIRUSSTOCKS
IN
SFL58-INSEKTENZELLEN
33
4.6.2.
BESTIMMUNG
DES
VPL-BAKULOVIRUSTITERS
MIT
HILFE
DES
PLAQUE-TESTS
33
4.6.3.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
VPL-PROTEIN
AUS
SFL58-INSEKTENZELLEN
MIT
REKOMBINANTEN
VPL-BAKULOVIREN
34
4.6.4.
ISOPYKNISCHE
CAESIUMCHLORIDDICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
35
4.6.5.
HERSTELLUNG
VON
35
S-RADIOAKTIV
MARKIERTEN
VP1
-VLPS
IN
SFL58-INSEKTENZELLEN
35
4.7.
CHEMISCHE
DISSOZIATION
UND
REASSOZIATION
VON
VPI-VLPS
36
4.7.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
CHEMISCHE
DISSOZIATION
VON
VP1
-VLPS
37
4.7.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
CHEMISCHEN
REASSOZIATION
VON
VPL-VLPS
37
4.8.
VERPACKUNG
VON
PLASMID-DNA
IN
VPL-VLPS
37
4.9.
TRANSDUKTION
VON
ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
VERMITTELT
DURCH
VPL-VLPS
38
4.10.
DNA-VERPACKUNG
IN
VPL-VLPS
DURCH
INSEKTENZELLEN
38
4.10.1.
DNA-VERPACKUNG
IN
INSEKTENZELLEN
38
4.10.2.
PRAEPARATION
VON
DNA-HALTIGEN
VPL-VLPS
AUS
INSEKTENZELLEN
39
4.10.3.
TRANSDUKTION
VON
ZELLEN
MIT
DNA-HALTIGEN
VPL-VLPS
AUS
INSEKTENZELLEN
39
4.11.
TRANSFEKTION
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
39
4.11.1.
TRANSFEKTION
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
MIT
DEAE-DEXTRAN
39
4.11.2.
TRANSFEKTION
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
MIT
DOTAP
40
4.11.3.
TRANSFEKTION
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
MIT
DER
ELEKTROPORATION
41
4.12.
VERPACKUNG
VON
PROPIDIUMJODID
IN
VPL-VLPS
41
4.13.
BESTIMMUNG
DER
ZELLTOXIZITAET
VON
VPL-VLPS
42
4.14.
NACHWEIS DER
BINDUNG
VON
3S
S-VPL-VLPS
AUF
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
42
4.15.
NACHWEIS
VON
PROTEIN-DNA-WECHSELWIRKUNGEN
MIT
HILFE
DES
SOUTH-WESTERN
BLOTS
43
4.15.1.
32
P-RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
PLASMID-DNA
43
4.15.2.
SOUTH-WESTERN
BLOT
44
4.16.
PRAEPARATION
VON
AMINOTERMINAL
HISTIDIN-MARKIERTEN
VPL-PROTEIN
AUS
E.COLI
44
4.17.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
45
4.17.1.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
45
4.17.2.
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
45
4.17.3.
NUKLEASE-BEHANDLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
46
4.17.4.
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA
MIT
HILFE
DER
KOMPETITIVEN
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
46
4.17.5.
ENTSALZUNG
VON
DNA-HALTIGEN
LOESUNGEN
48
4.17.6.
HERSTELLUNG
VON
TRANSFORMATIONSKOMPETENTEN
E.COLI-ZELLEN
FUER
DIE
ELEKTROPORATION
48
4.17.7.
ELEKTROPORATION
VON
E.COLI-ZELLEN
48
4.17.8.
PRAEPARATION
VON
GROESSEREN
MENGEN
PLASMID-DNA
(MIDI-PRAEP)
49
4.17.9.
BESTIMMUNG
VON
DNA-KONZENTRATIONEN
50
5.
ERGEBNISSE
51
5.1.
PRAEPARATION
UND
REINIGUNG VON
VPL-VLPS
51
5.1.1.
PRAEPARATION
UND
REINIGUNG
VON
VP1
-VLPS
AUS
DEM
ZELLKULTURUEBERSTAND
UND
DEM
ZELLEXTRAKTINFIZIERTER
SFL58-ZELLEN
52
5.1.2.
EINFLUSS
DER
PASSAGENZAHL
DER
INFIZIERTEN
SFL58-INSEKTENZELLEN
AUF
DIE
REINHEIT
DER
VPL-VLP-PRAEPARATIONEN
54
5.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
VPL-VLPS
55
5.2.1.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
GEREINIGTER
VPL-VLPS
55
5.2.2.
MORPHOLOGISCHER
VERGLEICH
VON
VPL-VLPS
MIT
JCV-PARTIKELN
57
5.2.3.
VERGLEICH
DER
HAEMAGGLUTINATIONSFAEHIGKEIT
VON
JCV-PARTIKELN
UND
VPL-VLPS
59
5.2.4.
ANALYSE
DER
IN
VPL-VLP-PRAEPARATIONEN
VORHANDENEN
NUKLEINSAEUREN
60
5.2.5.
DNA-BINDUNGSSTUDIEN
DES
VP1
-PROTEINS
MIT
HILFE
DES
SOUTH-WESTEM
BLOTS
62
5.2.6.
EINFLUSS
DER
VPL-VLPS
AUF
DAS
ZELLWACHSTUM
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
65
5.2.7.
BINDUNG
UND
INTERNALISIERUNG
DER
VPL-VLPS
IN
EUKARYOTISCHE
ZELLEN
66
5.2.7.1.
BINDUNGSSTUDIEN
MIT
35
S-MARKIERTEN
VPL-VLPS
AN
EUKARYOTISCHE
ZELLEN
67
5.2.7.2.
ANALYSE
DER
BINDUNG
UND
INTERNALISIERUNG
VON
VP1
-VLPS
MIT
DER
VPL-SPEZIFISCHEN
IMMUNFLUORESZENZ
69
53.
IN
VITRO
VERPACKUNG
VON
PLASMID-DNA
UND
TRANSDUKTION
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
76
5.3.1.
PCR-ANALYSE
DER
IN
VITRO-VERPACKUNG VON
PLASMID-DNA
IN
VPL-VLPS
77
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.2.
TRANSDUKTION
VON
COS-7-ZELLEN
MIT
IN
VITRO
VPL-VLP-VERPACKTER
PLASMID-DNA
79
5.4.
ANALYSE
DER
DISSOZIATIONS
UND
REASSOZIATIONSEIGENSCHAFTEN
VON
VPL-VLPS
8
1
5.4.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
DISSOZIATION
VON
VPL-VLPS
81
5.4.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REASSOZIATION
VON
VP1-PENTAMEREN
83
5.5.
QUANTIFIZIERUNG
DER
VERPACKUNG
VON
PLASMID-DNA
IN
VPL-VLPS
87
5.5.1.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
ZUR
VERPACKUNG
VON
PLASMID-DNA
IN
VPL-VLPS
87
5.5.2.
QUANTIFIZIERUNG
DER
VERPACKUNG
VON
PLASMID-DNA
88
5.6.
VPL-VLPS
ALS
TRANSPORTSYSTEM
FUER
PLASMID-DNA
IN
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
90
5.6.1.
VP1
-VLPS
ALS
TRANSPORTSYSTEM
FUER
PLASMID-DNA
AUF
COS-7-ZELLEN
90
5.6.1.1.
NACHWEIS
DER
VP1-VLP-VERMITTELTEN
DNA-EINSCHLEUSUNG
IN
COS-7-ZELLEN
MIT
HILFE
DES
SS-GALAKTOSIDASE-TESTS
91
5.6.1.2.
QUANTIFIZIERUNG
DER
VP1
-PROTEIN-VERMITTELTEN
DNA-EINSCHLEUSUNG
IN
COS-7-ZELLEN
92
5.6.1.3.
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
DER
VPL-VLPS
IN
COS-7-ZELLEN
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
ZU
VERPACKENDEN
DNA-MENGE
94
5.6.L4.
EINFLUSS
DER
INKUBATIONSDAUER
DER
VPL-VLPS
MIT
COS-7-
ZELLEN
AUF
DIE
EXPRESSIONSSTAERKE
95
5.6.L5.
VERGLEICH
DER
LUZIFERASEEXPRESSION
IN
COS-7-ZELLEN
NACH
VP1-VLP-VERMITTELTER
DNA-EINSCHLEUSUNG
UND
HERKOEMMLICHEN
TRANSFEKTIONSMETHODEN
96
5.6.L6.
EXPRESSIONSDAUER
NACH
VPL-VLP-VERMITTELTER
DNA-EINSCHLEUSUNG
IN
COS-7-ZELLEN
98
5.6.1.7.
EINFLUSS
VON
CHLOROQUINE
UND
POLYBREN
AUF
DIE
LUZIFERASEEXPRESSION
NACH
VPL-VLP-VERMITTELTER
DNA-EINSCHLEUSUNG
IN
COS-7-ZELLEN
100
5.6.2.
VPL-VLPS
ALS
TRANSPORTSYSTEM
FUER
PLASMID-DNA
IN
WEITEREN
ZELLINIEN
101
5.6.2.1.
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
IN
SVG-ZELLEN
101
5.6.2.2.
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
IN
TC-7-ZELLEN
103
5.6.2.3.
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
IN
LC-5-ZELLEN
104
5.7.
VERPACKUNG
VON
NIEDERMOLEKULAREN
SUBSTANZEN
IN
VPL-VLPS
105
6.
DISKUSSION
108
6.1.
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANT
EXPRIMIERTER
VPL-VLPS
108
6.1.1.
IN
INSEKTENZELLEN
EXPRITNIERTE
VP1
-VLPS
KOENNEN
IN
HOHER
REINHEIT
GEWONNEN
WERDEN
108
6.1.2.
REKOMBINANT
HERGESTELLTE
VPL-VLPS
WEISEN
DIE
GLEICHE MORPHOLOGIE
UND
BIOLOGISCHE
REAKTIVITAET
WIE
NATUERLICHE
JCV-VIRIONEN
AUF
110
6.1.3.
IN
VPL-VLP-PRAEPARATIONEN
SIND
DNA-UND
RNA-FRAGMENTE
ENTHALTEN
HO
6.1.4.
REKOMBINANT
EXPRIMIERTES
VPL-PROTEIN
BINDET
IN
VITRO
DNA
112
6.2.
WECHSELWIRKUNG
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
MIT
VPL-VLPS
114
6.2.1.
EINFLUSS
DER
VPL-VLPS
AUF
DAS
WACHSTUM
VERSCHIEDENER
ZELLINIEN
115
6.2.2.
BINDUNG
UND
INTERNALISIERUNG
DER
VPL-VLPS
IN
EUKARYOTISCHE
ZELLINIEN
115
63.
VERWENDUNG
DER
VPL-VLPS
ALS
TRANSPORTSYSTEM
FUER
PLASMID-DNA
116
6.3.1.
VPL-VLPS
VERPACKEN
IN
DEN
INSEKTENZELLEN
PLASMID-DNA
UND
VERMITTELN
EINE
DNA-EINSCHLEUSUNG
IN
EUKARYOTISCHE
ZELLEN
117
6.3.2.
VPL-VLPS
LASSEN
SICH
UNTER
GEEIGNETEN
BEDINGUNGEN
DISSOZIIEREN UND
NACHFOLGEND
WIEDER
ZU
VOLLSTAENDIGEN
VP1
-VLPS
ASSOZIIEREN
118
6.3.3.
IN
VITRO
DISSOZIIERTE
VPL-PENTAMERE
VERPACKEN
PLASMID-DNA
WAEHREND
IHRER
REASSOZIATION
119
6.3.4.
TRANSDUKTION
VON
COS-7-ZELLEN
MIT
VPL-VLPS
120
6.3.4.L
VERSCHIEDENE
FORMEN
DES
VPL-PROTEINS
SCHLEUSEN
DNA
IN
COS-7-ZELLEN
EIN
120
6.3.4.2.
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
TRANSDUKTION
DURCH
VPL-VLPS
121
OE.3.4.3.
VPL-VLP-EINGESCHLEUSTE
PLASMID-DNA
WIRD
NOCH
20
TAGE
NACH
TRANSDUKTION
EXPRIMIERT
121
6.3.5.
DIE
ANWESENHEIT
VON
CHLOROQUINE
ODER
POLYBREN
WAEHREND
DER
TRANSDUKTION
VERHINDERT
EINE
REPORTERGENEXPRESSION
122
INHALTSVERZEICHNIS
6.3.6.
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
DER
VPL-VLPS
IN
VERSCHIEDENEN
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
IM
VERGLEICH
MIT
HERKOEMMLICHEN
TRANSFEKTIONSMETHODEN
123
6.4.
VPL-VLPS
VERPACKEN
NIEDERMOLEKULARE
SUBSTANZEN
6.5.
AUSBLICK
124
124
7.
ZUSAMMENFASSUNG
126
8.
LITERATUR
128
9.
ANHANG
9.1.
GENOM
VON
JCV-MAD-1
9.2.
NUKLEINSAEURESEQUENZ
DES
VPL
-GENS
VON
JCV-MAD-1
93.
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
VPL-PROTEINS
VON
JCV-MAD-1
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146
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