Genanalyse des Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (uPa), Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) und Urokinaserezeptor (uPAR) in Ovarialkarzinomzellinien und -gewebe:
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
I.
EINLEITUNG
1
1.
DAS
OVARIALKARZINOM
1
2.
DIE
ROLLE
VON
PROTEASEN
BEI
DER
TUMORINVASION
2
3.
DER
PLASMINOGENAKTIVATOR
VOM
UROKINASETYP
(UPA)
6
4.
DER
PLASMINOGENAKTIVATORINHIBITOR-1
(PAI-1)
9
5.
DER
UROKINASEREZEPTOR
(UPAR)
11
6.
KLINISCH-ONKOLOGISCHE
BEDEUTUNG
VON
UPA,
PAI-1 UND
UPAR
14
II.
ZIELSETZUNG
17
III.
MATERIAL
UND
METHODEN
18
1.
MATERIAL
18
1
1.
TUMORZELLEN
18
1.2.
TUMORPROBEN
18
1
3.
BLUTPROBEN
20
14
OHGONUKLEOTIDE
20
1
5
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
22
2.
METHODEN
25
2.1.
ALLGEMEINES
25
2.2.
ZELLKULTUR
25
2.3
RIBONUKLEINSAEURE-EXTRAKTION
AUS
TUMORZELLEN
25
2.3.1
ALLGEMEINES
25
2.3
2.
RNA-EXTRAKTION
(NACH
CHOMCZYNSKI
U.
SACCHI,
1987)
26
2.3
3
RNA-EXTRAKTION
MIT
DEM
RNEASY
TOTAL
RNA
PURIFICATION-KIT
27
2.3
4.
QUALITAET
UND
QUANTITAET
DER
RNA
27
2.4
CDNA-SYNTHESE
27
2
4
1.
ALLGEMEINES
27
2.4
2
DURCHFUEHRUNG
29
2.5.
DNA-EXTRAKTION
AUS
TUMORGEWEBE
UND
BLUT
30
2.6
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
31
2
6
1
ALLGEMEINES
31
2.6
2.
DURCHFUEHRUNG
32
2
7
DNA-GELELKTROPHORESE
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
35
AUS
AGAROSEGELEN
2
8.
DNA-SEQUENZIERUNG
36
2
9
E.
CO/AKULTUR
37
2.91.
ZELLEN
37
2.9.2
ALLGEMEINES
37
2
9
3.
DURCHFUEHRUNG
37
INHALTSVERZEICHNIS
2.10.
MINIPRAEPARATION
VON
DNA
UND
ANSETZEN
VON
DAUERKULTUREN
38
2.10.1.
ALLGEMEINES
38
2.10.2.
DURCHFUEHRUNG
38
2.10.3.
HERSTELLUNG
VON
DAUERKULTUREN
39
2.11.
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNGEN
39
2.11.1.
ALLGEMEINES
39
2.11.2.
DURCHFUEHRUNG
40
2.12.
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
40
2.12.1.
ALLGEMEINES
40
2.12.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
LIGATION
41
2.12.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
TRANSFORMATION
41
2.13.
RESTNKTIONS-FRAGMENT-LAENGEN-POLYMORPHISMUS
(RFLP)
42
2.13.1.
ALLGEMEINES
42
2.13.2.
DURCHFUEHRUNG
43
2
14.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
44
2.14.1.
ALLGEMEINES
44
2.14.2.
DURCHFUEHRUNG
44
2.15
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
45
2.15.1.
ALLGEMEINES
45
2.15.2.
DURCHFUEHRUNG
45
IV.
ERGEBNISSE
47
1.
ANALYSE
DER
CDNA-SEQUENZ
VON
UPA,
PAI-1
UND
UPAR
ISOLIERT
47
AUS
DEN
HUMANEN
OVARIALKARZINOMZELLINIEN
OVCAR-3,
OV-MZ
6
UND
OV-MZ-19
1.1.
NACHWEIS
DER
MRNA
VON
UPA,
PAI-1
UND
UPAR
MITTELS
RT
47
PCR
1
2.
SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE
DER
PCR-PRODUKTE
VON
UPA,
PAI-1
50
UND
UPAR
1.3.
NACHWEIS
DER
HETEROZYGOTIE
DES
TRIPLETT
15
DES
PAI-1-IN
54
OV-MZ-6
DURCH
KLONIERUNG
1.4.
ANALYSE
DES
PAI-1-PROMOTORS
DER
ZELLINIEN
OVCAR-3,
56
OV-MZ-6
UND
OV-MZ-19
1.5
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
DES
UPAR-GENS
IN
OV-MZ-6
57
ZELLEN
DURCH
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
1.5
1.
KONSTRUKTION
DER
UPA-,
PAI-1-UND
UPAR-VEKTOREN
58
1.5.2.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
VON
UPAR-202
UND
UPAR-389-FRAGMENTE
63
1.5.3.
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
VON
OV-MZ-6
MIT
UPAR-389-SONDE
64
2.
ANALYSEN
DER
UPA-KRINGELREGION,
PAI-1-PROMOTORREGION
UND
67
PAI-1-SIGNALSEQUENZ
IN
OVARIALKARZINOMGEWEBE
2.1.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
OVARIALKARZINOMGEWEBE
UND
69
BLUTZELLEN
UND
PCR-AMPLIFIKATION
SPEZIFISCHER
DNA-FRAGMENTE
2.2.
ERGEBNISSE
DER
SEQUENZIERUNG
DER
UPA-KRINGELREGION,
PAI-1
70
PROMOTORREGION
UND
PAI-1-SIGNALSEQUENZ
AUS
TUMOR
UND
BLUTPROBEN
2.3.
NACHWEIS
DER
MUTATION
IN
DER
UPA-KRINGELREGION
DURCH
RFLP
75
INHALTSVERZEICHNIS
V.
DISKUSSION
76
1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZELLINIEN
OVCAR-3,
OV-MZ-6
UND
OV-MZ-19
AUF
GENETISCHER
EBENE
76
2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
UPAR-GENEXPRESSION
VON
OV-MZ-6
DURCH
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
81
3.
VERGLEICH
DER
GENVARIATIONEN
IN
DER
UPA-KRINGELREGION,
PAI-1
PROMOTORREGION
UND
PAI-1-SIGNALSEQUENZ
IN
TUMORPROBEN
MIT
KLINISCHEN
PARAMETERN
82
4.
AUSBLICK
86
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
87
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
89
VIII.
DANKSAGUNG
101
IX.
LEBENSLAUF
102 |
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