Studien zur Genstruktur, Regulation und Expression der Gene von GDNF und NDP, zweier Mitglieder der TGF-beta-Genfamilie:
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1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
DIE
NEUROTROPHEN
FAKTOREN
IN
DER
TGF-SS-SUPERFAMILIE
.
1
1.2.
GENTHERAPIE-KONZEPTE
.
2
1.2.1.
DIE
GENTHERAPIE
NEURODEGENERATIVER
ERKRANKUNGEN
.
3
1.2.2.
GENTHERAPIE
DES
MORBUS
PARKINSON
.
4
1.2.3.
TIERMODELLE
DES
MORBUS
PARKINSON
.
5
1.3.
UEBERLEBENSFOERDEMDE
FAKTOREN
FUER
DOPAMINERGE
NEURONEN
.
6
1.4.
GDNF-ERSTBESCHREIBUNG
.
6
1.4.1.
DIE
GENOMISCHE
ORGANISATION
DES
HUMANEN
GDNF
.
7
1.4.2.
DIE
ENDOGENE
EXPRESSION
VON
GDNF
.
8
1.4.3.
GDNF,
EIN
NEUROTROPHER
FAKTOR
NICHT
NUR
FUER
DOPAMINERGE
NEURONEN
.
8
1.4.4.
DER
GDNF-REZEPTOR
RET
.
9
1.4.5.
WEITERE
LIGANDEN
IM
RET-AKTIVIERENDEN
SYSTEM
.
10
1.4.6.
REZEPTOREN
IM
RET-AKTIVIERENDEN
SYSTEM
.
12
1.4.7.
GDNF
ALS
DIFFERENZIERUNGSFAKTOR
.
13
1.4.8.
MUTATIONSSUCHE
IM
GDNF-GEN
.
13
1.4.9.
EINSATZ
VON
GDNF
IN
DER
GENTHERAPIE
.
15
1.5.
DAS
NORRIE-PROTEIN
.
16
1.5.1.
KLINIK
DER
NORRIE-ERKRANKUNG
.
16
1.5.2.
KLONIERUNG
DES
NORRIE-GENS
.
17
1.5.3.
NORRIE-MUTATIONEN
.
18
1.5.4.
NORRIE-EXPRESSIONSMUSTER
.
19
1.5.5.
REKOMBINANTE
EXPRESSION
DES
NORRIE-PROTEINS
.
19
1.5.6.
DAS
NORRIE-PROTEIN,
EIN
LIGAND
OHNE
REZEPTOR
.
19
1.6.
AUFGABENSTELLUNG
.
21
2.
MATERIAL
.
22
2.1.
GERAETE
.
22
2.2.
DATENBANKEN
.
22
2.3.
COMPUTERPROGRAMME
.
22
2.4.
CHEMIKALIEN
.
23
2.5.
ENZYME
.
24
2.6.
GEBRAUCHSFERTIGE
LOESUNGEN
.
24
2.7.
ZELLINIEN
.
24
2.8.
GENOMISCHE
DNA
.
25
2.9.
PUFFER
UND
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
25
2.10.
KITS
.
25
2.11.
BAKTERIEN-STAEMME,
PLASMIDE
UND
PACS
.
25
2.12.
OLIGONUKLEOTIDPRIMER
.
26
2.13.
LAENGENMARKER
.
26
2.14.
SOUTHERN-,
WESTERN
UND
NORTHEM-BLOTS
.
26
2.15.
PROTEIN-ANTIKOERPER
.
27
2.16
ZYTOKINE
FUER
DIE
PROMOTORANALYSE
.
27
2.17.
PLASTIK-EINMALWARE
.
27
3.
METHODEN
.
28
3.1.
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
.
28
3.1.1.
AUFZUCHT
VON
BAKTERIENKULTUREN
.
28
3.1.2.
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
MIT
DER
CAC12-METHODE
.
28
3.2.
ARBEITEN
MIT
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
29
3.2.1.
LANGZEIT-KONSERVIERUNG
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
.
30
3.2.2.
TRANSFEKTION
FUER
TRANSIENTE
EXPRESSION
.
30
3.2.3.
PRAEPARATION
DER
ZELLEN
.
31
3.2.3.1.
ZELLYSATE
FUER
WESTEM-BLOTS
.
31
3.2.3.2.
ZELLYSATE
FUER
DEN
LUZIFERASE-ASSAY
.
31
3.2.4.
LUZIFERASE-ASSAY
.
32
3.3.
DNA-ARBEITSMETHODEN
.
34
3.3.1.
DNA-FAELLUNG
.
34
3.3.2.
DNA-PRAEPARATION
AUS
BAKTERIEN
.
34
3.3.3.
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
35
3.3.3.1.
LIGIERUNG
.
:
.
35
3.3.3.2.
TRANSFORMATION
.
35
3.3.4.
PCR
("POLYMERASE
CHAIN
REACTION
"
)
.
36
3.3.4.I.
RACE-PCR
.
36
3.3.4.2.
INVERSE
PCR
.
36
3.3.4.3.
PCR
ZUR
ANALYSE
VON
DNA-POLYMORPHISMEN
.
37
3.3.5.
RESTRIKTIONSENZYMVERDAU
ZUR
KARTIERUNG
VON
PACS
.
37
3.3.6.
GELELEKTROPHORESE
.
38
3.3.6.1.
PFGE
.
38
3.3.6.2.
HORIZONTALE
GELELEKTROPHORESE
.
39
3.3.7.
SOUTHERN-BLOT
.
39
3.3.8.
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHEM-BLOTS
.
39
3.3.8.1.
PRAEHYBRIDISIERUNG
.
40
3.3.8.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
.
40
3.3.8.3.
PRAEASSOZIIEREN
EINER
DNA-PROBE
.
41
3.3.8.4.
HYBRIDISIERUNG.
41
3.3.8.5.
WASCHEN
DER
FILTER
NACH
DER
HYBRIDISIERUNG
.
41
3.3.9.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
41
3.4.
RNA-METHODEN
.
42
3.4.1.
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
.
42
3.4.1.1.
RNA
AUS
ZELLKULTUR
.
42
3.4.1.2.
RNA
AUS
GEWEBESTUECKEN
.
42
3.4.2.
REVERSE
TRANSKRIPTASE
REAKTION
.
42
3.4.3.
RT-PCR
.
43
3.5.
PROTEIN-ARBEITSMETHODEN
.
43
3.5.1.
PROTEIN-ELEKTROPHORESEGELE
.
43
3.5.2.
WESTERN-BLOT
.
44
3.5.3.
ANTIKOERPERREAKTION
.
44
3.5.4.
IMMUNHISTOCHEMIE
.
45
4.
ERGEBNISSE
.
46
4.1.
ERSTELLEN
DER
GENOMISCHEN
STRUKTUR
-
KARTIERUNG
DES
GDNF-GENS
.
46
4.1.1.
ISOLIERUNG
EINES
PAC-KLONES,
DER
DIE
REGION
UM
DAS
GDNF-GEN
ENTHAELT
.
46
4.1.2.
LAGE
VON
EXON
A
UND
EXON
B
ZUEINANDER
UND
KARTIERUNG
DES
GESAMTEN
PACS
.
47
4.1.3.
VERGLEICHENDE
RESTRIKTIONSANALYSE
DES
PACS
MIT
GENOMISCHER
DNA
.
49
4.1.4.
HINWEISE
AUF
EIN
ZUSAETZLICHES
5
'-GDNF-EXON
.
49
4.1.5.
SEQUENZIERUNG
DES
5'-BEREICHS,
KLONIERUNGEN
UND
LANGSTRECKEN-PCRS
.
50
4.1.6.
ERSTELLUNG
DER
PHYSIKALISCHEN
KARTE
UM
DAS
GDNF-GEN
.
53
4.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
GDNF-CDNA
.
54
4.2.1.
ALTERNATIVE
TRANSKRIPTE
.
54
4.2.2.
RACE-EXPERIMENT
ZUR
ANALYSE
DES
TRANSKRIPTIONSSTART
UND DES
5
'-UTR
.
55
4.2.3.
DER
3
'-UTR
DES
GDNF-GENS
.
57
4.2.4.
VERGLEICH
DER
GDNF-CDNA
VON
MENSCH
UND
MAUS
.
59
4.2.5.
BESTIMMUNG
VON
EXON/INTRONGRENZEN
DES
GDNF-GENS
.
60
4.2.5.1.
EXON
1
UND
TRANSKRIPTIONSSTART
.
60
4.2.5.2.
EXON
2
.
60
4.2.5.3.
EXON
3
UND
POLYADENYLIERUNGSSIGNAL
.
60
4.2.6.
ANALYSE
DES
TRIPLET-REPEATS
IM
3'-UTR
DES
GDNF-GENS
.
61
4.3.
ANALYSE
DER
SEQUENZ
UM
EXON
1
UND
EXON
2
MIT
COMPUTERPROGRAMMEN
.
63
4.3.1.
YYRECOGNITION
OF
HUMAN
POLII
PROMOTER
REGION
AND
START
OF
TRANSCRIPTION
"
(TSSG/TSSW)
.
64
4.3.2.
"PROMOTER
PREDICTION
BY
NEURAL
NETWORK"
(PPNN)
.
67
4.3.3.
"PROMOTER
SCAN
II"
.
68
4.3.4.
"XGRAIL"-PROMOTOR-VORHERSAGE
.
68
4.4.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
BEIDEN
PROMOTOREN
.
68
4.4.1.
ERSTELLUNG
DER
PROMOTORKONSTRUKTE
.
69
4.4.2.
AKTIVITAET
UND
INDUKTION
DES
GDNF-PROMOTORS
VOR
EXON
1
.
71
4.4.3.
AKTIVITAET
DES
GDNF-PROMOTORS
VOR
EXON
2
.
73
4.5.
EXPRESSION
DER
DREI
VERSCHIEDENEN
GDNF-VARIANTEN
.
74
4.5.1.
WESTEMBLOT-ERGEBNISSE
.
75
4.5.2.
IMMUNZYTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
GDNF-VARIANTEN
.
76
4.6.
SPATIALES
UND
TEMPORALES
EXPRESSIONS-PROFIL
DES
NORRIE-GENS
.
78
4.7.
COMPUTERGESTUETZTE
SEQUENZANALYSE
DER
NORRIE-REGION
.
79
4.8.
NACHWEIS
VON
ENDOGENEM
NORRIE-PROTEIN
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
.
80
4.9.
EXPRESSIONSKONSTRUKTE
FUER
DAS
NORRIE-DISEASE-PROTEIN
.
81
4.9.1.
NDP-MYC-FUSIONSPROTEIN
.
81
4.9.2.
TETRAZYKLIN-REGULIERBARER
NDP-EXPRESSIONSVEKTOR
.
82
5.
DISKUSSION
.
83
5.1.
DIE
GDNF-GENFAMILIE
IM
VERGLEICH
.
83
5.2.
DIE
CHARAKTERISIERUNG
DES
GDNF-PROMOTORS
.
87
5.2.1.
COMPUTERGESTUETZTE
ANALYSE
UND
EXPERIMENT
.
87
5.2.2.
INDUKTIONSEXPERIMENTE
.
90
5.3.
WEITERE
VEROEFFENTLICHUNGEN
ZUM
GDNF-PROMOTOR
.
91
5.4.
EXPRESSION
UNTERSCHIEDLICHER
GDNF-VARIANTEN
.
93
5.5.
DER
GENOMISCHE
BEREICH
UM
DAS
NORRIE-GEN
.
95
5.5.1.
DIE
EXON/LNTRON-STNIKTUR
DES
NORRIE-GENS
.
95
5.5.2.
REGULATORISCHE
BEREICHE
IM
NORRIE-GEN
.
96
5.6.
VERGLEICH
DES
NORRIE-PROTEINS
MIT
GDNF.
97
5.7.
DIE
EXPRESSION
DES
NORRIE-GENS
.
99
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
102
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
104
8.
ANHANG
.
116
8.1.
PRIMER
.
116
8.2.
PCR-REAKTIONEN
.
119
8.3.
SEQUENZEN
.
120 |
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| spelling | Grimm, Lena 1969- Verfasser (DE-588)122025326 aut Studien zur Genstruktur, Regulation und Expression der Gene von GDNF und NDP, zweier Mitglieder der TGF-beta-Genfamilie von Lena Grimm 1999 [8], 124 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Univ., Diss., 1999 Transforming Growth Factor beta (DE-588)4370120-6 gnd rswk-swf Genregulation (DE-588)4122166-7 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Transforming Growth Factor beta (DE-588)4370120-6 s Genregulation (DE-588)4122166-7 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=008920591&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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