Identifizierung von metastasierungsassoziierten Genen durch differenzielle Analyse (SSH) und weiterführende Espressionsstudien in humanen Tumoren:
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Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe
2000
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen 1
Einleitung 3
Material 16
Methoden 22
1. Analyse von Nukleinsäuren 22
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Phenol/Chloroform Extraktion von Nukleinsäuren
Präzipitation von Nukleinsäuren aus wäßriger Lösung
2. DNA Methoden 23
2.1 DNA Präparation 23
Plasmid DNA Minipräparation
Plasmid DNA Maxipräparation
2.2 Klonierungstechniken 24
Fragmentierung von DNA Molekülen durch Restriktionsendonukleasen
Ligation von DNA Fragmenten
Polymerase Chain Reaction
Erststrang cDNA Synthese durch Reverse Transkription
Zweitstrang cDNA Synthese
Sequenzierung doppelsträngiger DNA
Präparation elektrokompetenter Bakterien
Elektrotransformation von Bakterien
Herstellung von Selektiv Agarplatten
Einfrieren von Bakterien
2.3 DNA Gelelektrophorese 28
Agarose Horizontalgelelektrophorese
DNA Isolation aus Agarose Gelen
3. RNA Methoden 29
Präparation von poly(A)+RNA aus Zellen
Präparation von Gesamt RNA aus Gewebe
Auftrennung von RNA durch Agarose Gelelektrophorese
Inhaltsverzeichnis
4. Transfer und Hvbridisierungstechniken 31
Radioaktive Markierung von DNA Fragmenten
Northern Blot Verfahren
Southern Blot Verfahren
Radioaktive Hybridisierung des Northern , bzw. Southern Blots
5. Zellkultur 33
Passagieren von Zellen
Einfrieren und Auftauen von Zellen
6. Histologische Techniken 34
Fixierung von Geweben
Einbettung in Paraffin
Markierung von RNA durch in viYro Transkription
Radioaktive Markierung von RNA durch in vifro Transkription
Nicht radioaktive Markierung von RNA durch in v/fro Transkription
/« s/fH Hybridisierung
Radioaktive /« « /M Hybridisierung (ISH)
Nicht radioaktive /n Mta Hybridisierung (FISH)
7. Differenzielle Subtraktion 39
Herstellung einer subtrahierten Bank mittels SSH
Abänderung des Protokolls: 2. Hybridisierungsrunde
Überprüfung der Subtraktionseffizienz/Driver cDNA Amplifikation
Ligation in einen TA Vektor
Transformation in elektrokompetente Bakterien und Blau/Weiß Sortierung
Picken von Klonen und Kolonie PCR
Reverse Northern Blot Analyse
Herstellung von Hybridisierungssonden der isolierten cDNA Fragmente
Ergebnisse 43
1 Das 13762NF Rattenadenokarzinomsvstem 43
2 Subtraktive Klonierung von differenziell exprimierten Genen 45
2.1 Prinzip der Suppressive Subtmctive Hybridization (SSH) 45
2.2 Durchführung der Subtraktionsreaktion 45
2.3 Eliminierung gemeinsam in Tester u. Driver Zellen
exprimierter Gene durch die SSH 49
2.4 Analyse von Klonen der Subtraktionsbank ML 50
Inhaltsverzeichnis
3 Charakterisierung der differenziell exprimierten Klone 52
3.1 Northern Blot Ana yse und Kontrollsequenzierung von
stichprobenartig gewählten Klonen 52
3.2 Identität aller differenziell exprimierten Gene 53
4 Bestätigung der differenziellen Expression durch Northern Blot Analyse 63
5 Expressionsstudie der metastasierungsassoziierten Gene in anderen
Tumorprogressionssystemen 64
5.1 Verwendete Modellsysteme 64
5.2 Zusammenhang zwischen Expression bereits identifizierter Gene
und dem metastatischen Potential von Zellinien 66
5.3 Zusammenhang zwischen Expression bisher unbekannter Gene
und dem metastatischen Potential von Zellinien 72
6 CD24 und S7 als potentielle Marker in humanen Tumoren 76
6.1 Expressionsstudien von S7 in menschlichen Tumoren durch
Northern Blot Ana yse 76
6.2 Expressionsstudien von CD24 und S7 in menschlichen
Tumoren durch /w s/fw Hybridisierung 77
6.2.1 Expression von CD24 in humanen Tumoren 79
6.2.2 Expression von S7 in humanen Tumoren 81
7 Expression von CD24 und S7 in verschiedenen Rattengeweben 83
Diskussion 86
Literatur 98
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