Untersuchungen zur Optimierung der genetischen Transformation von Raps (Brassica napus L.) mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens im Hinblick auf eine Modifikation der Fettsäurebiosynthese:
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Aachen
Shaker
2000
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| Schriftenreihe: | Berichte aus der Agrarwissenschaft
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| Beschreibung: | Zugl.: Gießen, Univ., Diss., 1999 |
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zur Optimierung der genetischen Transformation von Raps (Brassica napus L.) mit Hilfe
Autor: Khoschkhoi Yazdi, Mohammad Reza
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 4
2.1 Neue Wege in der Pflanzenzüchtung 4
2.2 Transformation durch direkten Gentransfer bei Brassica napus 5
2.3 Genetische Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens 8
2.3.1 Transformationsmechanismus 10
2.3.2 Geeignete Vektorsysteme 12
2.3.2.1 Cointegrative Vektoren 12
2.3.2.2 Binäre Vektoren 13
2.3.3 Charakteristika der A. tumefaciens-vermittelten Transformation 14
2.4 Co-Transformation 14
2.5 Selektion mit Hilfe von Resistenzgenen 15
2.6 Reportergene 17
2.7 Promotoren 18
2.8 Die pflanzliche Fettsäurebiosynthese 20
2.8.1 De novo-Synthese von Fettsäuren 20
2.8.2 Biochemische und physiologische Bedeutung der 23
Acyl-CoA-Synthetase für Ölpflanzen
3 Material und Methoden 26
3.1 Bakterienstämme und genetische Konstrukte 26
3.1.1 Kulturmedien für Bakterien 29
3.1.2 Aufbewahrung, Erhaltung und Vermehrung der Bakterien 29
3.1.3 Bestimmung der optischen Dichte von Bakterienstämmen 30
3.1.4 Einfluß unterschiedlicher Kulturmedien auf das
Bakterienwachstum 30
3.1.5 Auswahl der Agrobakterienstämme 31
3.1.5.1 Wirkung unterschiedlicher Infektions- und
Kokultivierungszeit auf die Transformationsrate 31
3.1.5.2 Effizienznachweis der eingesetzten Agrobakterienstämme 32
3.2 Beschreibung der verwendeten DNA 32
3.2.1 Die Herstellung und Lagerung kompetenter Zellen 32
3.2.2 Durchführung der Bakterien-Transformation 33
3.2.3 Selektion transformierter Bakterien 33
3.3 Molekulargenetische Verifikation der Bakterien-Transformation 33
3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Agrobacteriwn tumefaciens 33
3.3.2 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 34
3.3.3 Agarose-Gelelektrophorese der DNA 35
3.4 Selektionsmethodik 36
3.4.1 Stammlösungen von Antibiotika und Hormonen 36
3.4.2 Wirkung von Antibiotika auf die Selektion 37
3.4.3 Regenerationsmedien 37
3.5 Kotyledonen-Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens 38
3.5.1 Pflanzenmaterial 38
3.5.2 Vorbereitung des Pflanzenmaterials 39
3.5.3 Kulturmedien zur Ankeimung der Rapssamen 39
3.5.4 Ablauf der Transformation 39
3.6 Hypokotyl-Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens 40
3.6.1 Charakterisierung der Kulturmedien 40
3.6.2 Ablauf der Transformation 41
3.7 Versuch zum Vergleich der Hypokotyl- und Kotyledonen-
Transformation 41
3.7.1 Auswirkung von Silbernitrat auf die Sproßregeneration 41
3.7.2 Auswirkung von Acetosyringon und pH-Wert auf
die Transformation 42
3.7.3 Sproßregeneration aus Kallus 42
3.8 Transformation zur Übertragung der Acyl-CoA-Synthetase
aus E. coli in Raps
3.9 Nachweis der GUS-Expression
3.9.1 Stammlösungen und Puffer
3.9.2 Durchfuhrung der Tests
4 Ergebnisse
4.1 Kotyledonen-Transformation
4.1.1 Wachstumsverlauf der Bakterien in Abhängigkeit
vom Kulturmedium
4.1.2 Wachstumsverlauf der Bakterien in Abhängigkeit vom Stamm
4.1.3 Optimierung der Transformationsbedingungen
4.1.3.1 Effizienzvergleich von Bakterienstämmen
4.1.3.2 Einfluß der Hormonzusammensetzung auf die Sproßregeneration
4.1.3.3 Einfluß der Kanamycin-Selektion auf
die Sproßregeneration
4.1.3.4 Einfluß der Infektions- und Kokulturdauer
auf die GUS-Expression
4.2 Vergleich der Transformation von Hypokotyl- und Kotyledonen-
Explantaten unter Variation verschiedener Parameter
4.2.1 Einfluß von Explantatquelle, Genotyp, pH-Wert des Anzucht-
mediums und Acetosyringon auf die Stabilität der
GUS-Expression
4.2.2 Regeneration von GUS-positiven Sprossen aus
Hypokotyl- und Kotyledonen-Kallus
4.2.3 Der Einfluß von Silbernitrat auf die Sproßregeneration
4.3 Transformation von Raps mit Acyl-CoA-Synthetase über den
binären Vektor pNEC7
4.3.1 Verifikation der Transformation der Bakterienstämme LBA4404
undGV3101mitpNEC7
4.4 Agrobakterien-vermittelte Transformation von zwei
Brassica napiw-Genotypen 66
4.4.1 Selektion der Transformanten 66
5 Disknssion 71
5.1 Optimierung der Transformationsbedingungen für
Brassica napi«-Genotypen 71
5.1.1 Wachstum und Transfonnationseffizienz von drei 71
Agrobakterien-Stämmen
5.1.2 Der Einfluß der Induktion der vir-Region auf die 74
Transformationseffizienz
5.1.3 Selektion und Regeneration der Transformanten 76
5.1.3.1 Selektion mit Hilfe des nptll-Gens 76
5.1.3.2 Stimulation der Sproßregeneration durch gezielten Einsatz
von Phytohormonen und Silberaitrat 78
5.1.3.3 Die Morphogenese aus Kallus 83
5.2 Acyl-CoA-Synthetase-Gentransfer 84
6 Zusammenfassung 87
7 Summary 90
8 Literaturverzeichnis 92
9 Anhang 105
10 Abkürzungsverzeichnis 107
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