Untersuchungen zur Lokalisation, Genexpression und physiologischen Rolle der Plasmamembran-Aquaporine aus Arabidopsis thaliana:
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| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
Herdecke
GCA-Verl.
2000
|
| Edition: | Als Ms. gedr. |
| Series: | Forschen und Wissen - Biochemie
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1999 |
| Physical Description: | X, 198 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
| ISBN: | 393438949X |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
_
A:
ZUSAMMENFASSUNG
1
B:
EINLEITUNG
3
C:
MATERIAL
UND
METHODEN
9
1
MATERIAL
9
1.1
BIOLOGISCHES
MATERIAL
9
1.1.1
PFLANZEN
9
1.1.2
BAKTERIENSTAEMME
9
1.1.3
ENZYME
UND
ANTIKOERPER
10
1.1.4
VEKTOREN
UND
OLIGONUKLEOTIDE
10
1.2
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
14
13
GERAETE
16
1.4
LOESUNGEN
UND
NAEHRMEDIEN
17
1.4.1
LOESUNGEN
17
1.4.2
BAKTERIENMEDIEN
20
1.4.3
PFLANZENMEDIEN
21
2
ALLGEMEINE
ARBEITEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
22
2.1
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
22
2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
22
2.
1
.1.1
PLASMIDISOLIERUNG
MITTELS
QIAGEN*
UND
QIA-PREP-SPIN*
SAEULEN
22
2.1.1.2
PLASMID-DNA-PRAEPARATION
NACH
DER
STET-METHODE
22
2.1.2
ISOLIERUNG
VON
COSMID-DNA
23
2.1.3
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
DNA
24
2.1.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
25
2.1.4.1
PRAEPARATION
NACH
DEILAPORTA
ET
AL.
25
2.1.4.2
MINIPRAEPARATION
NACH
DER
CTAB-METHODE
26
2.1.5
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
PFLANZLICHEM
GEWEBE
27
2.1.6
PRAEPARATION
VON
POLY(A)
+
RNA
28
22
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
28
2.2.1
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
28
2.2.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
29
2.2.2.1
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
29
2.2.22
KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
IM
AGAROSEGEL
29
2.2.3
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNA
UND
RNA
30
IL
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
31
2.2.4.1
ZENTRIFUGATION
DURCH
QUARZWOLLE
31
2.2.4.2
ISOLIERUNG
MITTELS
DES
QIAGEN*
GEL-EXTRACTION
KIT
31
2.2.4.3
ISOLIERUNG
AUS
NIEDRIGSCHMELZENDER
AGAROSE
31
23
ENZYMATISCHE
MANIPULATION
VON
NUKLEINSAEUREN
32
2.3.1
SPALTUNG
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
32
2.3.2
ERZEUGUNG
VON
STUMPFEN
ENDEN
32
2.3.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5
'-DNA-ENDEN
32
2.3.4
LIGATIONEN
33
2.3.5
SUBKLONIERUNG
34
2.4
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
34
2.4.1
PRINZIP
DER
PCR
UND
IHRE
ANWENDUNG
34
2.4.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
ANSCHLIESSENDE
AMPLIFIZIERUNG
MITTELS
PCR
(RT-PCR)
36
2.4.3
QUANTITATIVE
PCR
37
2.5
YYSOUTHERN-ANALYSE
"
39
2.5.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
39
2.5.2
HERSTELLUNG
VON
NYLONFILTEM,
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
40
2.6
DNA-SEQUENZIERUNG
42
2.6.1
SEQUENZREAKTIONEN
42
2.6.2
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
IM
SEQUENZGEL
UND
DETEKTION
43
2.6.3
PRIMER-EXTENSION
44
2.6.4
DATENBANK-RECHERCHEN
UND
SEQUENZVERGLEICHE
45
3
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
46
3.1
AUFZUCHT
UND
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
46
3.1.1
ZUECHTUNG
VON
BAKTERIEN
IN
FLUESSIGKULTUR
46
3.1.2
ZUECHTUNG
VON
BAKTERIEN
AUF
AGARPLATTEN
46
3.1.3
GLYCERINKULTUREN
46
3.2
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
47
3.2.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
COLI
47
3.2.2
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
E.
COLI
STAEMMEN
47
33
TRANSFORMATION
VON
AGROBAKTERIUM
TUMEFACIENS
48
3.3.1
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
AGROBAKTERIUM
TUMEFACIENS
48
3.3.2
TRANSFORMATION
MITTELS
ELEKTROPORATION
49
4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
50
4.1
MIKROSOMALE
MEMBRANPRAEPARATION
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
BLAETTERN
50
4.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
51
4.2.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
MARKWELL
51
4.2.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
ESEN
52
43
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
53
INHALTSVERZEICHNIS
.111
4.4
YYWESTERN-ANALYSE
"
54
4.4.1
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
UND
PVDF-MEMBRANEN
54
4.4.2
INDIREKTER
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
PIP
55
4.4.2.1
ANTI-PIP-SPEZIFISCHE
PRIMAERE
ANTIKOERPER
55
4.4.2.2
ENZYM-KONJUGIERTER
SEKUNDAERER
ANTIKOERPER:
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
56
4.4.2.3
FLUORESZENZFARBSTOFF-GEKOPPELTER
SEKUNDAERER
ANTIKOERPER:
CY5
57
4.4.3
QUANTITATIVER
WESTERN
57
5
ARBEITEN
MIT
PFLANZENMATERIAL
59
5.1
ANZUCHT
VON
PFLANZEN
59
5.1.1
KULTIVIERUNG
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
AUF
ERDE
59
5.1.1.1
ANZUCHT
UNTER
NORMALEN
BEDINGUNGEN
59
5.1.1.2
ANZUCHT
UNTER
STRESSBEDINGUNGEN
60
5.1.2
KULTIVIERUNG
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
AUF
NAEHRMEDIUM
62
5.1.2.1
STERILISATION
VON
SAMEN
62
5.1.2.2
GEWINNUNG
VON
ARABIDOPSIS
Z/IA/IONA-KEIMLINGEN
AUF
AGAR-PLATTEN
62
5.1.2.2.1
ANZUCHT
UNTER
NORMALEN
BEDINGUNGEN
63
5.1.2.2.2
ANZUCHT
VON
ETIOLIERTEN
KEIMLINGEN
63
5.1.2.3
AUFZIEHEN
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
IN
FLUESSIGKULTUR
63
5.1.2.4
KULTIVIERUNG
VON
ARABIDOPSIS THALIANA
AUF
HYDROPONISCHEM
MEDIUM
64
5.1.3
KULTIVIERUNG
VON
ZEA
MAYS-KEIMLINGEN
65
5.2
ERZEUGUNG
TRANSGENER
PFLANZEN
DURCH
INFILTRATION
MIT
AGROBAKTERIEN
65
5.3
POLLENKEIMUNG
67
5.4
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
SS-GIUCURONIDASE-REPORTERGENS
67
5.4.1
BESTIMMUNG
DER
IN
VIFRO-AKTIVITAET
DER
SS-GLUCURONIDASE
IM
BLATTGEWEBE
67
5.4.2
GUS-FAERBUNG
VON
PFLANZENMATERIAL
68
5.4.3
HERSTELLUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
69
5.4.3.1
FIXIERUNG
UND
EINBETTUNG
GEFAERBTER
PFLANZENTEILE
UND
-ORGANE
69
5.4.3.2
MIKROSKOPIE
UND
ARBEITEN
AM
MIKROTOM
70
5.5
PHYSIOLOGISCHE
METHODEN
71
5.5.1
BESTIMMUNG
DER
ABNAHME
DES
FRISCHGEWICHTS
VON
BLATTGEWEBE
71
5.5.2
BESTIMMUNG
DES
13
C/
12
C-VERHAELTNISSES
VON
BLATTGEWEBE
71
5.5.3
BESTIMMUNG
DER
CHLOROPHYLLFLUORESZENZ
VON
BLATTGEWEBE
72
5.5.4
MESSUNG
DER
STOFFTRANSPORTGESCHWINDIGKEIT
UEBER
DIE
AUFNAHME
STABILER
ISOTOPE
75
77
D:
ERGEBNISSE
1
PIP-GENE
77
1.1
DNA-SEQUENZEN
DER
PIP-GENE
77
1.1.1
ANZAHL
DER
PIP
IM
ARABIDOPSIS
THALIANA
GENOM
77
1.1.2
HOMOLOGIEVERGLEICHE
UND
NAMENGEBUNG
77
1.2
GENOMORGANISATION
79
2
EXPRESSION
DER
EINZELNEN
PIP-MITGLIEDER
81
2.1
ISOLIERUNG
DER
PROMOTORBEREICHE
81
2.2
DNA-SEQUENZANALYSE
DER
PROMOTORBEREICHE
84
2.2.1
PROMOTOR-UND
REGULATORISCHE
ELEMENTE
84
2.2.2
HOMOLOGIEN
DER
PROXIMALEN
PROMOTORBEREICHE
86
23
KONSTRUKTION
VON
PZP-PROMOTOR-GUS-FUSIONSVEKTOREN
87
2.3.1
PIPLA;:GUS
88
2.3.2
PIPLC::GUS
89
2.3.3
PIP2A::GUS
90
2.3.4
PIP2B::GGS
91
2.3.5
PIP2C::GUS
93
2.3.6
PIP2E::GUS
94
2.4
NACHWEIS
DES
TRANSGENS
IN
DEN
KANDIDATENLINIEN
95
2.4.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
96
2.4.2
RT-PCR:
NACHWEIS
DES
GUS-GENS
AUF
MRNA-EBENE
97
2.4.3
SOUTHERN-ANALYSE
97
2.4.4
IN
VIZRO-NACHWEIS
DER
PROMOTORAKTIVITAET
101
2.5
EXPRESSIONSMUSTER
102
2.5.1
BLAETTER
IN
VERSCHIEDENEN
ENTWICKLUNGSSTADIEN
103
2.5.1.1
MAKROSKOPISCHE BEOBACHTUNGEN
103
2.5.1.2
MIKROSKOPISCHE ANALYSEN
105
2.5.1.3
P/P-MRNA
GEHALT
IN
WILDTYPPFLANZEN
107
2.5.1.4
PROTEIN-EXPRESSIONSNIVEAU
IN
WILDTYPPFLANZEN
108
2.5.2
GENEXPRESSION
IN
WURZELN
109
2.5.3
EXPRESSION
IN
BLUETEN
UND
SCHOTEN
111
2.5.4
GENEXPRESSION
IN
SONSTIGEN
ORGANEN
114
3
SENSE
UND
ANTISENSE-PFLANZEN
117
3.1
TRANSGENE
PFLANZENLINIEN,
DIE
PIP-AQUAPORIN-SENSE
UND
ANTISENSE-KONSTRUKTE
EXPRIMIEREN
117
3.2
AUSWAHLKRITERIEN
ZUR
KLASSIFIZIERUNG
DER
TRANGENEN
LINIEN
118
3.2.1
BESTIMMUNG
DER
AQUAPORIN-EXPRESSIONSNIVEAUS
MITTELS
QUANTITATIVER
WESTERN-ANALYSE
118
INHALTSVERZEICHNIS
_
,
_
Y
3.2.2
SEGREGATION
119
3.2.2.1
SEGREGATIONSDATEN
IN
DER
TJ
UND
TJ-GENERATION
119
3.2.2.2
ERMITTLUNG
DER
ART
DER
INSERTION
AUS
DEN
SEGREGATIONSDATEN
120
3.2.3
VERGLEICH
DER
PROTEINEXPRESSION
MIT
DEN
SEGREGATIONSDATEN
121
3.2.4
BESTIMMUNG
DES
MRNA-GEHALTS
MITTELS
QUANTITATIVER
PCR
122
4
REGULATION
DER
PIP
125
4.1
PHAENOTYPISCHE
ANALYSEN
VON
WILDTYP
SOWIE
SENSE
UND
ANTISENSE
PFLANZEN
UNTER
VERSCHIEDENEN
ANZUCHTBEDINGUNGEN
126
4.1.1
KONTROLLBEDINGUNGEN
128
4.1.2
GRADUELLER
TROCKENSTRESS
129
4.1.3
SALZSTRESS
130
4.2
EXPRESSIONSNIVEAUS
DER
PIP
IN
WILDTYPEN
SOWIE
SENSE
UND
ANTISENSE-PFLANZEN
131
4.2.1
VERGLEICH
DER
MRNA-MENGEN
MITTELS
QUANTITATIVER
PCR
131
4.2.1.1
EINFLUSS
VON
TROCKENSTRESS
AUF
DIE
PIP-EXPRESSION
IM
WILDTYP
132
4.2.1.2
EINFLUSS
VON
SALZSTRESS
AUF
DIE
PIP-EXPRESSION
IM
WILDTYP
134
4.2.1.3
VERGLEICH
DER
PIP-EXPRESSION
TRANSGENER
PFLANZEN
MIT
DEM
WILDTYP
UNTER
VERSCHIEDENEN
STRESSBEDINGUNGEN
135
4.2.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINEXPRESSION
MITTELS
QUANTITATIVER
WESTERN-ANALYSE
137
4.3
VERGLEICH
DER
SENSE
UND
ANTISENSE-PFLANZEN
MIT
DEM
WILDTYP
AUF
PHYSIOLOGISCHER
EBENE
139
4.3.1
BESTIMMUNG
DER
ABNAHME
DES
FRISCHGEWICHTS
IN
BLAETTERN
139
4.3.2
BESTIMMUNG
DES
13
C/
L2
C-VERHAELTNISSES
141
4.3.3
MESSUNG
DER
CHLOROPHYLLFLUORESZENZ
142
4.3.4
MESSUNG
DER
STOFFTRANSPORTGESCHWINDIGKEIT
UEBER
DIE
AUFNAHME
STABILER
ISOTOPE
146
E:
DISKUSSION
149
1
DIEPZP-GENE
149
2
FUNKTIONELLE
ASPEKTE
DER
AUSGEWAEHLTEN
AQUAPORINE
150
2.1
LOKALISIERUNG
DER
EINZELNEN
PIP-MITGLIEDER
150
2.1.1
EXPRESSIONSSTUDIEN
150
2.1.2
FAZIT
DER
EXPRESSIONSSTUDIEN
154
2.2
ANALYSE
VON
SENSE
UND
ANTISENSE-LINIEN
UNTER
VERSCHIEDENEN
UMWELTBEDINGUNGEN
155
2.2.1
SENSE-UND
ANTISENSE-LINIEN
155
VI
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2
ROLLE
DER
AQUAPORINE
BEI
DER
STRESSBEWAELTIGUNG
156
3
AUSBLICK
160
F:
LITERATURVERZEICHNIS
163
G:
ANHANG
175
DANKSAGUNG
179
LEBENSLAUF
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