Genexpression in menschlichen Osteoblasten:
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| Language: | German |
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Herdecke
GCA-Verl.
2000
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| Edition: | Als Ms. gedr. |
| Series: | Forschen und Wissen - Gentechnik
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss. 1999 |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
Problemstellung 8
2 Material und Methoden 9
2.1 Material 9
2.1.1 Chemikalien 9
2.1.2 Geräte 10
2.1.3 Sonstige Materialien 11
2.1.4 Medien und Lösungen 11
2.1.5 Oligonukleotide 12
2.1.6 DNA Molekulargewichtstandards 13
2.2 Methoden 14
2.2.1 Isolierung von Gesamt RNA 14
2.2.2 Anreicherung von poly(A)* RNA 15
2.2.3 Synthese von Erststrang cDNA 15
2.2.4 Synthese von Zweitstrang cDNA und enzymatische Reaktionen zur Vorbereitung der cDNA zur
Klonierung 16
2.2.5 Grbßenfraktionierung von cDNA 17
2.2.6 Auftrennung von DNA Agarosegelelektrophorese 18
2.2.7 Auftrennung von RNA 19
2.2.8 Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli 20
2.2.9 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 21
2.2.10 Transfer von DNA aus Agarosegelen auf Nylon Membranen (Southemblot) 22
2.2.11 Herstellung von DNA Dotblots mit einer Dotblot Apparatur für 96 Proben 23
2.2.12 Herstellung von „High Density Dotblots 24
2.2.13 Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA 26
2.2.14 Herstellung radioaktiv markierter DNA Sonden 27
2.2.15 Herstellung elektrokompetenter £. co/i Bakterien 30
2.2.16 Transformation von E. coli durch Elektroporation 31
2.2.17 Sequenzierung von DNA 31
2.2.18 Automatisierte nicht radioaktive Hybridisierung von „High Density Kolonie Dotblots mit
Oligonukleotiden 40
2.2.19 Bestimmung der Konzentration von DNA mit Hilfe des „Ethidiumbromid Plating Assays 42
2.2.20 Herstellung biotinylierter RNA aus cDNA Banken 43
2.2.21 Abtrennung der mit Biotin markierten Moleküle nach der subtraktiven Hybridisierung 43
2.2.22 Adaptorligationen beim „Supprcssion Subtractive Hybridisation Verfahren 44
2.2.23 Suppressor PCR 45
II Inhaltsverzeichnis
2.2.24 Subtraktive Hybridisierung nach dem „Suppression Subtractive Hybridisarion Verfahren 47
3 Ergebnisse 4g
3.1 Herstellung von cDNA Banken aus humanen Knochenzellen 4g
3.1.1 Herstellung von cDNA Banken aus nicht induzierten und induzierten primären humanen
Knochenzellen zur Methodenetablierung 4g
Isolierung von mRNA aus primären humanen Knochenzellen 48
Synthese der cDNA 50
Größenfraktionierung der cDNA j2
Klonierung der cDNA im Plasmid Vektor pBluescript II SKXKAsc 54
Experimente zur Analyse der cDNA Banken 56
3.1.2 Herstellung je einer cDNA Bank aus nicht induzierten und induzierten primären humanen
Knochenzellen 50
Isolierung von mRNA aus primären humanen Knochenzellen 59
Synthese der cDNA ,50
Größenfraktionierung der cDNA g;
Klonierung der cDNA in ftnf multiplexfähige Plasmid Vektoren 63
Experimente zur Analyse der cDNA Banken 5J
3.2 Herstellung subtraktiver cDNA Banken aus humanen Knochenzellen. «7
3.2.1 Herstellung von subtraktiven cDNA Banken für induzierte und nicht induzierte primäre humane
Knochenzellen durch Hybridisierung biotinylierter RNA mit einzelsträngiger cDNA 68
Herstellung von biotinylierter in vitro transkribierter RNA aus den cDNA Banken 68
Vorversuch zur Subtraktion mitteis biotinylierter RNA 70
Synthese der einzelsträngigen cDNA und subtraktive Hybridisierung 71
Synthese des zweiten cDNA Stranges und Größenfraktionierung 72
Klonierung der subtrahierten cDNA 74
Experimente zur vorläufigen Analyse der cDNA Banken ..74
3.2.2 Herstellung einer subtraktiven cDNA Bank für induzierte primäre humane Knochenzellen mit dem
„Suppression Subtractive Hybridisation Verfahren 76
Synthese der cDNA und Spaltung mit Rsal 78
UgationderAdaptoren 79
a) Optimierung der Adaptor Ugation g0
b) Ugation der Adaptoren an die cDNA unter optimierten Bedingungen «2
Analyse der Ligationsprodukte durch die Suppressor PCR g3
Subtraktive Hybridisierung Suppressor PCR . 87
Optimierung der Bedingungen bei der Suppressor PCR gg
Analyse der subtrahierten cDNA „„
Klonierung der subtrahierten cDNA
Inhaltsverzeichnis III
3.3 Analyse der subtraktiven cDNA Banken. 94
3.3.1 Analyse der subtraktiven Genbanken für nicht induzierte Knochenzellen subGB und induzierte
Knochenzellen subGB+ 95
Mulliplex DNA Sequenzierung 95
Auswertung der Sequenzdaten 101
Weitere Untersuchungen der sequenzierten cDNA Klone mit dem Reversen Northemblot 104
Herstellung der Membranen für den Reversen Northemblot 105
Herstellung der Hybridisierungssonden 105
Besondere Bedingungen beider Verwendung von Sonden aus einer cDNA Bank 107
Auswahl der zu untersuchenden Klone 107
Versuch zur Erhöhung der Spezifilät der Hybridisierung HO
Hybridisierung mit einer Sonde aus mRNA 113
Entwicklung eines „Pseudo Nonhemblots 115
3.3.2 Analyse der subtraktiven Genbanken für induzierte Knochenzellen, die nach dem „Slippression
Subtractive Hybridisation Verfahren hergestellt wurden 120
Ampliflzierung der cDNA Insertionen 120
Herstellung eines „High Density Dotblots mit 384 Proben und Hybridisierung mit radioaktiv markierten
cDNA Sonden 122
Herstellung von „High Density Dotblots mit 1.536 Proben und Hybridisierung mit radioaktiv markierten
cDNA Sonden 126
Sequenzierung der ausgewählten cDNA Fragmente 132
Überprüfung der Ergebnisse des „Reversen Northernblots durch einen „Pseudo Northernblot 137
3.4 Weitergehende Analysen der Kandidatenklone 138
3.4.1 Untersuchung der cDNAs der unbekannten Kandidatengene durch Hybridisierung mit den
cDNA Banken für nicht induzierte bzw. induzierte Knochenzellen 138
Suche nach Sequenzinformation in den öffentlich zugänglichen Datenbanken 138
Hybridisierung mit „High Density Kolonie Dolblots 139
a) Herstellung der Membranen 140
b) Optimierung der Bedingungen für die automatische Hybridisierung mit dem Membranprozessor
MPR3000. 140
Ergebnisse der automatischen Hybridisierung der „High Density Membranen 141
Sequenzierung der differentiell exprimierten cDNA Klone 146
Verlängerung der Sequenzen durch PCR und Recherche in nicht öffentlich zugänglichen Datenbanken 147
3.4.2 Untersuchung einiger ausgewählter Kandidatenklone durch in iifu Hybridisierung mit
Mäuseembryonen 1^0
4 Diskussion 154
4.1 Die Metboden zur systematischen Untersuchung der Genexpression in
menschlichen Osteoblaaten 15*
IV Inhaltsverzeichnis
Aus Knochenzellen kann hochwertige RNA isoliert werden die begrenzte Zahl an Knochenzellen erfordert
die Anwendung neuer Methoden zur Untersuchung der Genexpression 154
Herstellung von cDNA Banken für primäre humane Knochenzellen 155
Bei der Klonierung der cDNA in Plasmid Vektoren konnten ausreichend viele unabhängige cDNA Klone
erhalten werden 155
Die Art der Größenfraktionierung ist ausschlaggebend für die durchschnittliche Größe der Monierten
cDNA Fragmente und die Ausbeute an cDNA für die Klonierung 156
Die Effektivität der Ligation der cDNA mit dem Plasmid Vektor hängt vom molaren Verhältnis der cDNA
zur Plasmid DNA und der Präparation der Plasmid DNA ab 157
Herstellung und Analyse der subtraktiven cDNA Banken subGB und subGB+ 158
Die Herstellung von RNA durch in vitro Transkription bei gleichzeitigem Einbau biotinylierter
Nukleotide als Alternative zur Photobiotinylierung von mRNA 158
Die Herstellung subtraktiver cDNA Banken mit in vitro transkribierter biotinylierter RNA kann zur
Verringerung der durchschnittlichen Länge der klonierten cDNA führen 158
Die Verwendung von in vitro transkribierter biotinylierter RNA zur Subtraktion kann sich auf die
Zusammensetzung der subtraktiven Genbank auswirken 159
Die Multiplex DNA Sequenzierung als schnelle und kostengünstige Alternative für die Massen¬
sequenzierung 159
Können in einer subtraktiven cDNA Bank die differentiell exprimierten Gene allein durch die Sequenzierung
einiger Hundert cDNA Klone und die daraus ermittelte Häufigkeit identifiziert werden ? 160
Der Reverse Northernblot ein Hochleistungsverfahren zur Analyse der Genexpression mit kleinen
Schwachstellen 161
Der „ Pseudo Northemblot als Verfahren zur Kontrolle der Ergebnisse des Reversen Northemblots 163
Anwendung der „Suppression Subtractive Hybridisation Methode zur Identifizierung differentiell
exprimierter Gene in humanen Knochenzellen 163
Die publizierten Adaptorsequenzen mussten überarbeitet werden 164
Die Suppressor PCR amplifiziert bevorzugt die Moleküle, die unterschiedliche Adaptoren an ihren Enden
besitzen 164
Während der „Suppression Subtractive Hybridisation Methode werden viele cDNAs abgereichert, andere
angereichert 165
Entwicklung eines sensitiven Hybridisierungsverfahrens mit einem hohen Probendurchsatz zur
Identifizierung von cDNAFragmenten differentiell exprimierter Gene 166
Der Anteil der cDNAs differentiell exprimierter Gene in den subtraktiven Genbanken Key 1.2 und Key 1.3
liegt im Bereich der Publikationen anderer Autoren 167
Die cDNA Klone von möglicherweise induzierten Genen enthielten zu einem hohen Prozentsatz cDNA
Fragmente für ein Gen des Vitamin D Stoffwechsels 168
Die Verteilung der differentiell exprimierten Gene in der subtraktiven cDNA Bank hängt von den
Bedingungen bei der Herstellung der Banken ab 168
Die Signalstärke beim Reversen Northernblot wird von der Häufigkeit des jeweiligen cDNA Fragmenls
in der subtraktiven Genbank beeinftusst 169
Mit der Untersuchung von etwa 3.000 Klonen konnten 75 verschiedene differentiell exprimierte Gene
identifiziert werden fürfast alle konnte die Induktion in mehreren Zellchargen nachgewiesen werden 169
Inhaltsverzeichnis V
Die Rsal Fragmenle vom 3 Ende der mRNAs oder von kurzen mRNAs ohne Rsal Erkennungsstelle sind
in der subtraktiven Genbank unterrepräsentiert 170
Hybridisierung mit „High Density Membranen als Methode zur Ermittlung der, Häufigkeit bestimmter
cDNAs in verschiedenen cDNA Banken und zur Isolierung längerer cDNA Klone 171
4.2 Genexpression in menschlichen Knochenzellen (Osteoblaslen) 172
Untersuchung der cDNA Banken für primäre humane Knochenzellen 172
Der Nachweis der cDNA eines Markergens flir reife Osteoblaslen in den cDNA Bankenfür humane
Knochenzellen 172
Sequenzierung der 3 Enden von 40 zufällig ausgewählten cDNAs aus den cDNA Bankenfur humane
Knochenzellen 172
Untersuchung der subtraktiven cDNA Banken subGB und subGB+ 173
Analyse der sequenzierten cDNA Fragmente aus den subtraktiven cDNA Banken subGB und subGB+ 173
Die Analyse der subtraktiven cDNA Bank subGB+ mit dem Reversen Northernblot ermöglichte eine
Vorauswahl von möglicherweise differentiell exprimierten Genen 174
Durch in situ Hybridisierung konnte für den cDNA Klon +D149 eine spezifische Expression im sich
bildenden Knochen nachgewiesen werden 174
Untersuchung der subtraktiven cDNA Banken Keyl .2 und Keyl J 175
Analyse der differentiell exprimierten Gene, die mit Hilfe des Reversen Northernblots gefunden wurden 175
Die Hybridisierung mit den cDNA Banken und die Datenbank Recherche ermöglichten für einige der
unbekannten Gene die Ermittelung der vollständigen cDNA Sequenz 177
Untersuchung ausgewählter cDNA Klone durch in situ Hybridisierung ISO
5 Zusammenfassung 182
6 Literaturverzeichnis 183
Anhang 190
Abkürzungsverzeichnis. 205
Lebenslauf. 207
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