Regulation von Zellzyklus-Kontrollproteinen bei der Masernvirus-induzierten Immunsuppression (in vitro):
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 BIOLOGIE DES MASERNVIRUS (MV) 1
1.1.1 TAXONOMIE UND STRUKTUR 1
1.1.2 NICHT-STRUKTURELLE MV-PROTEINE 4
1.1.3 REPLIKATION UND TRANSKRIPTION 5
1.2 MV-ERKRANKUNGEN 6
1.2.1 DIE AKUTE MV-LNFEKTION 6
1.2.2 ZENTRALNERVOESE MV-ERKRANKUNGEN 7
1.3 MV IM TIERMODEL 8
1.4 MV-INDUZIERTE IMMUNSUPPRESSION 9
1.4.1 MV-KONTAKTVERMITTELTE IMMUNSUPPRESSION
IN VITRO 11
1.5 ZELLZYKLUSKONTROLLE AM YYRESTRICTION POINT" 13
1.5.1 P53 13
1.5.2 REGULATION DER KINASEAKTIVITAET VON CDK-KOMPLEXEN 15
1.6 ZIELSETZUNG 19
2 MATERIAL
20
2.1 VERSUCHSTIERE 20
2.2 ZELLEN 20
2.2.1 PRIMAERE ZELLEN 20
2.2.2 ZELLINIEN 20
2.3 VIREN 21
2.4 ANTIKOERPER 21
2.5 MEDIEN, CHEMIKALIEN, ENZYME 22
2.5.1 MEDIEN/ZELLKULTUR 22
2.5.2 ENZYME 22
2.5.3 CHEMIKALIEN 22
2.6 RADIOAKTIV MARKIERTE SUBSTANZEN 23
2.7 LOESUNGEN UND PUFFER 23
2.8 VERBRAUCHSMATERIAL 24
2.9 GERAETE 24
3 METHODEN 25
3.1 VIRUSZUCHT 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.1.1
3.1.2
3.1.3
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3.2.11
3.3
3.3.1
3.3.2
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
3.4.5
3.4.6
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
3.5.4
3.5.5
3.5.6
35.7
II
HERSTELLUNG EINES VIRUSSTOCKS 25
VIRUSTITER-BESTIMMUNG DURCH ENDPUNKTTITRATION 25
VIRUSTITER-BESTIMMUNG DURCH PLAQUETEST 26
HERSTELLUNG VON MOCK 26
UV-LNAKTIVIERUNG VON MV- UND VSV-SUSPENSIONEN 26
ZELLKULTUR 27
VERO-ZELLEN 27
BJAB, J16, MOLT-4 27
KRYOKONSERVIERUNG DER ZELLEN 27
ISOLIERUNG VON PBL AUS PERIPHEREM HUMANEM BLUT 28
HERSTELLUNG EINER ZELLSUSPENSION AUS MURINEN MILZZELLEN 28
HERSTELLUNG EINER LYMPHKNOTENZELLSUSPENSION VON BAUMWOLLRATTEN
(SIGMODON HISPIDUS)
29
TRYPANBLAU-EXKLUSION 29
MYKOPLASMENTEST 29
GEWINNUNG LYTISCH MV-INFIZIERTER PBL ALS .PRESENTER ZELLEN" (PZ) 30
GEWINNUNG PERSISTIEREND MV-INFIZIERTER BJAB (BJAB-EDP) ALS PZ 30
KOKULTIVIERUNGSANSATZ 30
BESTIMMUNG DER ZELLULAEREN PROLIFERATIONSAKTIVITAET 31
PROLIFERATIONSTEST VON HUMANEN UND MURINEN RZ
IN VITRO 31
PROLIFERATIONSTEST MIT LYMPHKNOTENZELLEN VON BAUMWOLLRATTEN
IN VITRO 31
ZELLTEILUNGS- UND ZELLZYKLUSANALYSE 32
ZELLTEILUNGSANALYSE MIT CFSE-FAERBUNG 32
DURCHFLUSSZYTOMETRIE ZUR ZELLTEILUNGSANALYSE MIT CFSE-FAERBUNG 32
ZELLZYKLUSANALYSE MIT PROPIDIUMJODID-FAERBUNG 32
DURCHFLUSSZYTOMETRIE ZUR ZELLZYKLUSANALYSE MIT PROPIDIUMJODID-FAERBUNG 32
ZELLZYKLUSANALYSE MIT BROMODEOXYURIDIN (BRDU)/PROPIDIUMJODID-FAERBUNG 33
DURCHFLUSSZYTOMETRIE ZUR ZELLZYKLUSANALYSE MIT BRDU/PROPIDIUMJODID-
DOPPELFAERBUNG 34
PROTEINDETEKTION IN ZELLYSATEN 34
HERSTELLUNG VON ZELLYSATEN FUER WESTERN BLOT-ANALYSE 34
PROTEINBESTIMMUNG 34
AUFTRENNUNG EINES PROTEINGEMISCHES DURCH SDS-PAGE 34
WESTERN BLOT 35
IMMUNFAERBUNG UND ANALYSE DER DURCH WESTERN BLOT TRANSFERIERTEN
PROTEINE 36
MEHRFACHNUTZUNG EINES WESTERN BLOTE 37
PROTEINFAERBUNG MIT COOMASSIE-BLAU 37
III
3.6 BESTIMMUNG VON KINASEAKTIVITAETEN
IN VITRO 37
3.6.1 HERSTELLUNG VON ZELLYSATEN FUER
IN VITRO-KINASEASSAYS 37
3.6.2 IMMUNPRAEZIPITATION FUER
IN VITRO-KINASEASSAYS 38
3.6.3
IN VITRO-KINASEASSAY 38
3.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE PROTEINDETEKTION 38
3.7.1 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERTXMG VON CD3, CD25, CD38, CD69
UND CD71 38
3.7.2 IMMUNZYTOCHEMISCHE FAERBUNG VON P53 39
3.7.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ZUR BESTIMMUNG VON P53 UND EXTRAZELLULAEREN
PROTEINEN 39
4 ERGEBNISSE 41
4.1 EINFLUSS VON UV-INAKTIVIERTEN MASEMVIREN AUF DIE PROLIFERATION
MITOGENSTIMULIERTER PBL 41
4.2 PROLIFERATIONSAKTIVITAETEN HUMANER ZELLINIEN UND MITOGENSTIMULIERTER
PBL
BEI KOKULTIVIERUNG MIT PERSISTIEREND MV-INFIZIERTEN BJAB-ZELLEN
(BJAB-EDP) ALS PRESENTER ZELLEN (PZ) 42
4.3 VERTEILUNG DER RZ IM ZELLZYKLUS 44
4.3.1 ZELLZYKLUSANALYSE MITOGENSTIMULIERTER PBL NACH KOKULTIVIERUNG MIT
BJAB-EDP ALS PZ UND NACH KOKULTIVIERUNG MIT UV-MV 46
4.3.2 ZELLZYKLUSANALYSE (MIT PROPIDIUMJODID-FAERBUNG) VON J16-, MOLT-4-
UND BJAB-ZELLEN ALS RZ NACH KOKULTIVIERUNG MIT BJAB-EDP ALS PZ 46
4.3.3 ZELLZYKLUSANALYSE DER PZ-KOKULTIVIERTEN RZ MIT
BRDU/PROPIDIUMJODID-
DOPPELFAERBUNG
51
4.3.4 ZELLZYKLUSANALYSE SYRTCHRONISIERTER RZ 54
4.3.5 ZELLZYKLUSANALYSE MITOGENSTIMULIERTER PBL (RZ) NACH KOKULTIVIERUNG
MIT PZ IN ANWESENHEIT VON NOCODAZOL 56
4.3.6 ZELLZYKLUSANALYSE VON J16-, MOLT-4- UND BJAB-ZELLEN ALS RZ NACH
KOKULTIVIERUNG MIT PZ IN ANWESENHEIT VON NOCODAZOL 58
4.4 ZELLZYKLUSVERTEILUNG, APOPTOSEINDUKTION UND PROLIFERATIVE AKTIVITAET
HUMANER PBL NACH KOKULTIVIERUNG MIT PZ BZW. UV-MV IN ABHAENGIGKEIT
VON KOKULTIVIERUNGSZEIT UND MITOGENER VORSTIMULATION 59
4.5 ANALYSE DER ZELLTEILUNGSFIREQUENZ DER RZ NACH KOKULTIVIERUNG MIT PZ
62
4.6 BESTIMMUNG DES P53-GEHALTS UV-MV-KOKULTIVIERTER RZ 66
4.7 PROLIFERATIVE AKTIVITAET MURINER P53-DEFIZIENTER MILZZELLEN NACH
KOKULTIVIERUNG MIT PZ 56
4.8
IN WFRO-KINASEAKTIVITAET VON CDK-KOMPLEXEN IN EXTRAKTEN AUS
MITOGENSTIMULIERTEN PBL (RZ) 70
IV
4.8.1
IN
V/FRO-KINASEAKTIVITAET VON CDK4-KOMPLEXEN IN EXTRAKTEN AUS
MITOGENSTIMULIERTEN PBL (RZ)
5 6 7 8 9 101
4.8.2
IN
WFRO-KINASEAKTIVITAET VON CDK6-KOMPLEXEN IN EXTRAKTEN AUS
MITOGENSTIMULIERTEN PBL (RZ)
^
1
4.8.3
IN
VFLRO-KINASEAKTIVITAET VON CDK2-KOMPLEXEN IN EXTRAKTEN AUS
MITOGENSTIMULIERTEN PBL (RZ) 71
4.9 P27
IOP1-EXPRESSION IN EXTRAKTEN AUS MITOGENSTIMULIERTEN PBL (RZ) 74
4.10 CDK4-, CDK6-, CDK2-, CYCLIN D3- UND CYCLIN E-EXPRESSION IN
EXTRAKTEN AUS MITOGENSTIMULIERTEN PBL (RZ) 77
4.11 EXPRESSIONSANALYSE VON AKTIVIERUNGSMARKEM AUF DER OBERFLAECHE
UV-MV-KOKULTIVIERTER RZ 81
4.12 CDK4- UND CDK2-EXPRESSION IN EXTRAKTEN AUS MITOGENSTIMULIERTEN
MURINEN MILZZELLEN (RZ) 84
4.13 CDK4- UND CDK2-EXPRESSION IN EXTRAKTEN AUS STIMULIERTEN
LYMPHKNOTENZELLEN MV-INFIZIERTER BAUMWOLLRATTEN 86
5 DISKUSSION 89
5.1 PROLIFERATIVE AKTIVITAET VON PZ-KOKULTIVIERTEN BZW.
UV-MV-KOKULTIVIERTEN RZ 89
6.2 ZELLZYKLUSVERTEILUNG UND ZELLTEILUNGSFREQUENZ PZ- BZW.
UV-MV-KOKULTIVIERTER RZ 91
5.3 AKTIVITAET UND EXPRESSION VON ZELLZYKLUS-KONTROLLPROTEINEN BEI DER
MV-INDUZIERTEN PROLIFERATIONSHEMMUNG 98
6 ZUSAMMENFASSURIG 11
7 SUMMARY 112
8 LITERATURVERZEICHNIS 11*
9 ABKUERZUNGEN 130
10 LEBENSLAUF 133 |
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