RelB moduliert die NF-kappaB-abhängige Genexpression in T-Lymphozyten durch Komplexbildung mit RelA und c-Rel:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. DIE STELLUNG DER T-LYMPHOZYTEN IM IMMUNSYSTEM 1
1.2. DIE REIFUNG DER T-LYMPHOZYTEN 2
1.3. DIE AKTIVIERUNG DER T-LYMPHOZYTEN
K 3
13 1 TYROSINKINASEN UND PHOSPHATASEN 5
13 2 DIE FAMILIE DER PHOSPHOLIPASEN C 7
13 3 DIE PROTEINKINASE C (PKC) FAMILIE 8
1 3 4 DIE MAPK-SIGNALKASKADEN 9
13 5 KALZIUM [CA
2 ] VERMITTELTE SIGNALE IN T-LYMPHOZYTEN 11
1.4. TN FA INDUZIERTE SIGNALKASKADEN 12
1.5. DAS
NF-KB-SYSTEM 14
15 1 DIE FAMILIE DER NF-ICB/REL-FAKTOREFRI 15
15 2 DIE FAMILIE DER
NF-KB INHIBITOREN: DIE IKBS 19
15.3
DIE SIGNALTRANSDUKTION IM NF-XB-SYSTEM 22
15 4 DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR RELB HAT EINE SONDERSTELLUNG
INNERHALB DER NF-XB/REL-FAMILIE 24
1.6. PROBLEMSTELLUNG 25
2. MATERIAL UND METHODEN 27
2.1. MATERIAL 27
2 1.1. BAKTERIEN 27
2 1.2. GEWEBEKULTURZELLEN 27
2 13. NAEHRMEDIEN 27
214 CHEMIKALIEN UND REAKTIONSSYSTEME 28
2 1.5. GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIAL 30
2 1 6 LOESUNGEN UND PUFFER 31
2.1.7. ENZYME 37
2.1.8 GROESSENMARKER 37
2.1.9. VERWENDETE PLASMIDE 37
2
110. OLIGONUKLEOTIDE 44
2
111. ANTIKOERPER 45
2.2. METHODEN 46
2 2.1 KLONIERUNGSTECHNIKEN 46
2 2 11 SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 46
2.2.1.2 AUFFULLEN VON DNA-ENDEN DURCH DIE KJENOW-POLYMERASE 46
2.2.1.3. PHOSPHATASE-BEHANDLUNG 47
2.2 1 4 LIGATION VON DNA-MOLEKUELEN 47
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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TO TO R J
2.2 1.5 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSE 48
2.2 2 MODIFIKATION VON DNA-MOLEKUELEN 48
2.2.21. /#/
VITRO MUTAGENESE 48
2.2.2.2. AMPLIFIKATION VON DNA MITTELS PCR 49
2.2 3. SEQUENZIERUNG VON DNA 50
2.2 4 QUANTIFIZIERUNG VON MRNA 50
2.2.4.1. ISOLATION VON RNA AUS EUKARYONTISCHEN ZELLEN 51
2 2 4 2. DIE RNASE-PROTEKTIONS ANALYSE ' 51
2.2.5. BAKTERIENKULTUREN 53
2.2 5.1. UEBERNACHTKULTUREN 53
2.2.5 2. ERHALTUNGSKULTUREN 53
2.2.5.3 HERSTELLUNG VON KOMPETENTEN BAKTERIEN 53
.2 5 4. TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN BAKTERIEN 54
.25.5 MINIPRAEPERATION VON PLASMID-DNA 54
2 5 6. MAXIPRAEPERATION VON PLASMID-DNA 55
2 2 6 ZELLKULTUR ' . 56
2.2 6 1 ISOLATION VON PRIMAEREN HUMANEN T-LYMPHOZYTEN 56
2.2 6.2 ISOLATION VON PRIMAEREN MURINEN T-LYMPHOZYTEN 57
2.2 6.3. TRANSFEKTION MIT DEM SUPERFECT-REAGENZ 58
2.2.6 4. INDUKTION DER ZELLEN 58
2 2 6.5 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON ZELLEN MIT
?5S-MARKIERTEN
AMINOSAEUREN 59
2 2 7. PRAEPERATION VON PROTEINEXTRAKTEN 60
2 2 7 1 PRAEPERATION VON GESAMTPROTEINEXTRAKTEN AUS
EUKARYONTISCHEN ZELLEN 60
2 2.7.2. HERSTELLUNG VON KERNPROTEIN- UND ZYTOPLASMAEXTRAKTEN VON
EUKARYONTISCHEN ZELLEN 60
2.2.7.3. GEWINNUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN 61
2.2 8 DAS LUZIFERASE-GEN ALS INDIKATORGEN 62
2.2.81. DER YYLUZIFERASE-ASSAY" 62
2.2 8 2. DER SS-GALAKTOSIDASE-ASSAY 62
2.2.83. BERECHNUNG DER RELATIVEN LUZIFERASE-AKTIVITAET 63
2.2.9 IMMUNBLOT-ANALYSE 63
2 2 9.1. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 64
2 2.9.2. TRANSFER AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN 64
2.2 9.3 IMMUN-DETEKTION 65
2.2.9 4. ABLOESUNG (YYSTRIPPING") DER ANTIKOERPER
VON NITROZELLULOSEMEMBRANEN 65
2 2.10. IMMUNPRAEZIPITATION 66
2.2.11.
LN VITRO PHOSPHORYLIERUNGSSTUDIEN 67
2 2
11.1//; VITRO PHOSPHORYLIERUNGSSTUDIEN MIT GEBUNDENEN
PROTEINEN 67
2 2 11.2.
LN VITRO PHOSPHORYLIERUNGSSTUDIEN MIT
IMMUNPRAEZIPITIERTEN KINASEN 68
2.2 12 DNA/PROTEIN-BINDUNGSSTUDIEN 69
2.2.12 1. HYBRIDISIERUNG (YYANNAELING") VON EINZELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDEN 69
2 2 12.2 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER OLIGONUKLEOTIDE MIT
12P 69
2.2 12.3 AUFREINIGUNG VON
,2P-MARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN 70
2 2 12.4 DERYYEMSA" 71
3. ERGEBNISSE 73
3.1. DER NEGATIVE EFFEKT VON CSA AUF DAS NF-ICB-SYSTEM BERUHT
AUF EINER HEMMUNG DER SIGNAL-INDUZIERTEN PHOSPHORYLIERUNG
DER NF-ICB-INHIBITOREN 73
3 11. CSA INHIBIERT DIE NF-TCB-AKTIVITAET IN JURKAT T-ZELLEN 73
3 1 2 DIE INDUZIERBARE DNA-BINDUNG VON NF-ICB-KOMPLEXEN
WIRD DURCH CSA VERMINDERT 74
3 13. DIE VERMINDERTE NUKLEAERE TRANSLOKATION VON NF-KB-FAKTOREN
IST EINE KONSEQUENZ DER CSA-BEHANDLUNG 77
3 1 4 DIE PROZESSIERUNG DES VORLAEUFERPROTEINS PL05/NF-KBL WIRD
NICHT DURCH CSA BEEINFLUSST 81
3.1.5. DIE
DE NOVO SYNTHESE DER NF-ICB/REL-PROTEINE BLEIBT IN
JURKAT-ZELLEN DURCH CSA UNBEEINFLUSST 82
3 1.6 DIE SIGNAL-INDUZIERTE PHOSPHORYLIERUNG DES
IKBOI WIRD DURCH
CSA INHIBIERT 84
3.2. RELB MODULIERT DIE AKTIVITAET DER NF-ICB-PROTEINE P65/RELA
UND C-REL IN T-LYMPHOZYTEN 87
3 2 1 NACH T-ZELL-AKTIVIERUNG WIRD RELB INDUZIERBAR DEGRADIERT 87
3 2.2 NUR IN T-LYMPHOZYTEN FUHRT DER SIGNAL-INDUZIERTE ABBAU ZU
EINER REDUKTION DER RELB-KONZENTRATION 89
3 2.3 DIE MECHANISMEN DES RELB-ABBAUS AEHNELN DENEN DER
I KBA-DEGRADATION 91
3.2.4. THREONIN 84 UND SERIN 552 IM AMINO- BZW. CARBOXYTERMINUS
VON RELB WERDEN SIGNAL-INDUZIERBAR PHOSPHORYLIERT 94
3.2 5. SUBSTITUTIONEN DER PHOSPHO-AKZEPTOREN THR-84 UND SER-552
STABILISIEREN RELB IN JURKAT-ZELLEN 95
3.2.6 RELB HEMMT DIE RELA-VERMITTELTE TRANSKRIPTIONELLE AKTIVITAET 99
3.2.7. DIE UEBEREXPRESSION VON RELB IN EL-4 T-ZELLEN VERAENDERT DIE
ZUSAMMENSETZUNG DER DNA-GEBUNDENEN NF-KB-KOMPLEXE 99
3 2 8 RELB BILDET KOMPLEXE MIT RELA/P65 UND C-REL
IN VIVO 102
3.2.9. DIE UEBEREXPRESSION VON RELB IN EL-4 T-ZELLEN MODULIERT DIE
INDUZIERTE EXPRESSION VON NF-TCB-ZIELGENEN 104
3 2 10 DIE MAP-KINASE ERK2, NICHT ABER JNK.1/2, PHOSPHORYLIERT
RELB ///
VITRO 109
3 2.11. DAS IKK-SIGNALOSOM BINDET NACH STIMULATION AN RELB UND
PHOSPHORYLIERT DIESEN FAKTOR IN VITRO 112
T
4. DISKUSSION 116
4.1. DIE INHIBITION DER SIGNAL-INDUZIERTEN PHOSPHORYLIERUNG DER
IIEB-PROTEINE IST DIE MOLEKULARE BASIS DER N'F-KB-HEMMUNG
DURCH DEN IMMUNSUPPRESSOR CSA 116
4 11 VERMINDERTE KEMLOKALISATION UND DNA-BINDUNG VON
NF-KB
DURCH CSA 116
4 1.2. DIE SIGNAL-INDUZIERTE PHOSPHORYLIERUNG DES IICBA WIRD DURCH
CSA GEHEMMT 119
4.2. DIE INDUZIERBARE DEGRADATION VON RELB IST EIN NEUER
REGULATIONSMECHANISMUS IM NF-ICB-SYSTEM 122
4.2.1. UEBERLAPPENDE SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE REGULIEREN DIE SIGNAL
INDUZIERTE DEGRADATION VON RELB UND IICBA 122
4.2.2 DIE ZWEIPHASIGE DEGRADATION IST SPEZIFISCH FUER RELB 125
4.2.3. DURCH KOMPLEXBILDUNG MIT RELB WERDEN RELA UND C-REL GEHEMMT 126
4.2.4. DIE UEBEREXPRESSION VON RELB IN EL-4 ZELLEN MODULIERT
DIE NF-XB-ABHAENGIGE GENEXPRESSION NACH TPA-IONOMYCIN-
STIMULATION 128
5. ZUSAMMENFASSUNG 133
5.1. DEUTSCHE ZUSAMMENFASSUNG 133
5.2. ENGLISCHE ZUSAMMENFASSUNG (SUMMARY) 135
6. LITERATURVERZEICHNIS 138
7. ABKUERZUNGEN 162
8. LEBENSLAUF 166
9. VEROEFFENTLICHUNGEN 168 |
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