Untersuchungen zur Phosphorylierung des Ecdysteroidrezeptors und Hormon-Rezeptor-Interaktionen bei verschiedenen Subklonen der epithelialen Zellinie von Chironomus tentans:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS:
A EINLEITUNG
A. 1 DIE UEBERFAMILIE DER STEROID- UND THYROIDHORMONREZEPTOREN 1
A.2 COFAKTOREN DER NUKLEAEREN REZEPTOREN 5
A.3 PHOSPHORYLIERUNG ' 6
A.4 DIE EPITHELIALE ZELLKULTUR VON
CHIRONOMUS TENTANS 7
A. 5 ZIELE DER ARBEIT 8
B MATERIAL UND METHODEN
B. 1 MATERIAL 9
B.1.1 CHEMIKALIEN - 9
\
B.1.2 ANTIKOERPER UND ANTISEREN 10
B.1.3 GERAETE 10
B.1.4 SONSTIGES MATERIAL 11
B.1.5 SOFTWARE 11
B.2 METHODEN 11'
B.2.1
CHIRONOMUS TENTANS -ZELLKULTUR 11
B.2.2 INKUBATION DER ZELLEN MIT 20-OH-ECDYSON ODER RH 5992 12
B.2.3 ERNTE DER ZELLEN 12
B.2.4 HERSTELLUNG VON ZELLHOMOGENATEN 13
B.2.5 ENTSALZUNG DER PROBEP 13
B.2.6 KOMPETITIONSTEST 14
B.2.7 SCATCHARD-PLOT 14
B.2.8 FILTERTEST 16
B.2.9 PROTEINBESTIMMUNG 16
B.2.10 ENZYMATISCHE DEPHOSPHORYLIERUNG 17
B.2.11 REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) 17
B.2.12 FAST PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (FPLC) 18
B.2.13 TCA-PRAEZIPITATION VON PROTEINEN AUS WAESSRIGER LOESUNG 18
B.2.14 SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 18
B.2.15 SILBERFAERBUNG 19
B.2.16 WESTEM-BLOT 20
B.2.17 DOT-BLOT 20
B.2.18 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION 20
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
B.2.19 AFFINITAETSREINIGUNG DES PABCE/D-SERUMS GEGEN DEN
ECDYSTEROIDREZEPTOR 22
B.2.20 ENTWICKLUNG, AUSWERTUNG UND DARSTELLUNG DER ROENTGENFILME 23
B.2.21 BAKTERIELLE EXPRESSION NUKLEAERER REZEPTOREN 23
B.2.22 IN-VITRO-TRANSLATION NUKLEAERER REZEPTOREN 23
B.2.23 ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) 24
B. 2.24 EMSA-BLOT 25
C ERGEBNISSE '
C. 1 UNTERSUCHUNGEN ZUR LIGANDENBINDUNG DES ECDYSTEROIDREZEPTORS 26
C. 1.1 NACHWEIS ZWEIER HOCHAFFINER BINDESTELLEN (BS1 & BS2) 26
C.1.2 BESTIMMUNG DER UNSPEZIFISCHEN BINDUNG 27
C.1.3 LIGANDENBINDUNG IN-VITRO-TRANSLATIERTER REZEPTOREN 32
C.1.4 LIGANDENBINDUNG BAKTERIELL EXPRIMIERTER REZEPTOREN 35
C.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR ECDYSTEROID-RESISTENZ VERSCHIEDENER SUBKIONE DER
EPITHELIALEN ZELLINIE VON
CHIRONOMUS TENTANS
38
C.2.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR HORMONBINDUNG RESISTENTER SUBKIONE 38
C.2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR DNA-BINDUNG RESISTENTER SUBKIONE 40
C.2.3 DIE SPEZIFISCHE HORMONBINDUNG DES KLONS RH-R.3 WIRD DURCH ZUGABE
DES
ECDYSTEROIDREZEPTORS WIEDERHERGESTELLT 43
C.3 PHOSPHORYLIERUNG DES ECDYSTEROIDREZEPTORS UND ULTRASPIRACLE
VON
CHIRONOMUS TENTANS
44
C.3.1 DIE ISOTYPEN DES ECDYSTEROIDREZEPTORS UND VON ULTRASPIRACLE SIND
PHOSPHOPROTEINE 44
C.3.2 VERGLEICH DER ELEKTROPHORETISCHEN MOBILITAET VERSCHIEDENER FORMEN
DES
ECDYSTEROIDREZEPTORS UND VON ULTRASPIRACLE 46
C.3.3 HORMONEINFLUSS AUF DAS PHOSPHORYLIERUNGSMUSTER DES
ECDYSTEROIDREZEPTORS
UND VON ULTRASPIRACLE 48
C.3.4 EINFLUSS DER DEPHOSPHORYLIERUNG AUF DIE HORMON- UND DNA- BINDUNG 50
C.3.5 ECDYSTEROIDREZEPTOR UND ULTRASPIRACLE EXISTIEREN AUCH IN
HOCH-MOLEKULAREN
KOMPLEXEN 53
C.3.6 VERGLEICH VON CYTOSOLISCHEN UND NUKLEAEREN REZEPTOREN 58
C.3.7 EINFLUSS DER DEPHOSPHORYLIERUNG AUF DIE KOMPLEXE 61
C.3.8 EINFLUSS VON 20-OH-ECDYSON AUF DIE KOMPLEXE 63
C.4 CHARAKTERISIERUNG EINES NEUEN ANTISERUMS GEGEN DEN
ECDYSTEROIDREZEPTOR AUS
CHIRONOMUS TENTANS
64
C.4.1 EINFLUSS DES ABSCE-A/B-SERUMS AUF DIE SPEZIFISCHE LIGANDENBINDUNG
DES ECDYSTEROIDREZEPTORS 70
INHALTSVERZEICHNIS
D DISKUSSION
D.1 LIGANDENBINDUNG 73
D.2 ISOFORMEN 82
D.3 PHOSPHORYLIERUNG 86
D.4 ANTISEREN GEGEN DEN ECDYSTEROIDREZEPTOR UND ULTRASPIRACLE 93
D.5 HORMON-RESISTENTE SUBKLONE 96
E ZUSAMMENFASSUNG 101
F LITERATURVERZEICHNIS 103
ABKUERZUNGEN 123
DANKSAGUNG 125 |
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