Endophytische Pilze aus Trifolium repens L. mit besonderer Berücksichtigung isolierter Hefen und deren taxonomischer Einordnung:
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Berlin [u.a.]
Cramer
2000
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5
ENDOPHYTISCHE PILZE AUS TRIFOLIUM REPENSL. MIT BESONDERER
BERUECKSICHTIGUNG ISOLIERTER HEFEN UND DEREN TAXONOMISCHER EINORDNUNG
VON DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET
DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA
ZU BRAUNSCHWEIG
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINER
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
(DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE
DISSERTATION
VON
IRA MARQUARDING AUS BREMEN
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS » III
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 WAS SIND ENDOPHYTEN? 1
1.1.1 DEFINITION 1
1.1.2 VORKOMMEN 2
1.1.3 BEDEUTUNG EINER ENDOPHYTISCHEN BESIEDELUNG 3
1.2 TAXONOMIE , 4
1.2.1 ZUR MORPHOLOGIE UND PHYSIOLOGIE VON PILZEN 5
1.2.2 PILZCHARAKTERISIERUNG MIT MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODEN 6 1.3
ZIEL DER ARBEIT 7
2 MATERIAL UND M E T H O D EN 8
2.1 PROBENNAHME 8
2.1.1 STANDORTE 8
2.1.2 MATERIALGEWINNUNG 8
2.2 PILZISOLIERUNG 8
2.2.1 EPIPHYTEN 8
2.2.2 ENDOPHYTEN 9
2.2.2.1 OBERFLAECHENSTERILISATION 9
2.2.2.2 UEBERPRUEFUNG DER STERILISATION 9
2.2.2.3 VEREINZELUNG 10
2.3 STAMMHALTUNG UND REFERENZSTAEMME 12
2.3.1 STAMMHALTUNG FUER MYCELPILZE 12
2.3.2 STAMMHALTUNG FUER HEFEPILZE 12
2.3.3 REFERENZSTAEMME 12
2.4 TAXONOMISCHE EINORDNUNG DER ISOLATE 13
2.4.1 SPORULATIONSANREGUNG BEI MYCELPILZEN 13
2.4.2 MIKROSKOPIE 14
2.4.2.1 FAERBUNGEN UND LICHTMIKROSKOPIE 14
2.4.2.1.1 FAERBUNG MIT MILCHSAUREM ANILINBLAU . 14 2.4.2.1.2 FAERBUNG MIT
TRYPANBLAU 14
2.4.2.2 SEKUNDAERELEKTRONENMIKROSKOPIE (SEM) 15
2.4.3 MORPHOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN . .. 16 2.4.3.1
CHARAKTERISIERUNG VON HEFEPILZEN 16
2.4.3.2 IDENTIFIZIERUNG NACH BARNETT ET AL. (1990) . . .. 18
2.4.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 19
2.4.4.1 DNA-EXTRAKTION 19
2.4.4.2 DNA-GEHALTSBESTIMMUNG 20
2.4.4.3 GELELEKTROPHORESE UND DNA-QUALITAET 20
IMAGE 3
IV INHALTSVERZEICHNIS
2.4.4.4 PCR-RFLP 20
2.4.4.4.1 PCR MIT ITS-PRIMERN : 21
2.4.4.4.2 RESTRIKTIONSVERDAU DES ITS-AMPLIKONS 22 2.4.4.4.3
FRAGMENTLAENGEN-POTYMORPHISMEN . .. 22 2.4.4.5 RAPD 25
2.4.4.5.1 PCR MIT ZUFALLSPRIMERN 25
2.4.4.5.2 PRIMERWIRKSAMKEIT 26
2.4.4.5.3 DNA-KONZENTRATION UND BANDEN- MUSTER 27
2.5 AEHNLICHKEITSANALYSEN 27
2.6 REINFEKTION 28
2.6.1 ANZUCHT AXENISCHER KLEEPFLANZEN 28
2.6.2 INFEKTIONEN 30
2.6.3 REISOLIERUNG 31
2.7 NACHWEIS ENDOPHYTISCHER PILZE IM BLATT 31
2.7.1 EPIDERMISPRAEPARATION 31
2.7.2 GEWEBEDUENNSCHNITTE 31
2.7.3 APOPLASTENFLUESSIGKEIT 32
2.7.4 FLUORESZENZFAERBUNGEN 32
2.7.4.1 CALCOFLUOR 33
2.7.4.2 DAPI (4,6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOL) 33 2.7.4.3 FDA
(FLUORESCEINDIACETAT) 33
2.7.4.4 ANILINBLAU, BASISCH 34
ERGEBNISSE 35
3.1 ISOLIERTE EPIPHYTEN 35
3.2 ISOLIERTE ENDOPHYTEN 35
3.3 IDENTIFIZIERUNG DER ENDOPHYTEN 37
3.3.1 ENDOPHYTISCHE MYCELPILZE 37
3.3.2 MORPHOLOGIE ENDOPHYTISCHER HEFEPILZE 40
3.3.3 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN GETESTETER HEFEPILZE 41 3.3.4
AEHNLICHKEITSANALYSEN MIT WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN . . .. 48 3.3.5
PCR-TECHNIKEN 51
3.3.5.1 DNA-EXTRAKTION UND DNA-QUALITAET 51 3.3.5.2 PCR-RFLP 53
3.3.5.2.1 GELELEKTROPHORESE UND AUSWERTUNG . . 53 3.3.5.2.2 MUSTER
MITTELS RESTRIKTIONSENZYMEN . 54 3.3.5.2.3 AEHNLICHKEITSANALYSEN 58
3.3.5.3 KOMBINATION PHYSIO- UND MOLEKULARBIOLOGI- SCHER DATEN 62
3.3.5.4 RAPD 67
3.3.5.4.1 PRIMERWIRKSAMKEIT / DNA-QUANTITAET . 67 3.3.5.4.2
DNA-AMPLIFIZIERUNG 67
3.3.5.4.3 SUCHE NACH IDENTISCHEN ISOLATEN . . .. 68 3.4 REINFEKTION 70
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS J V
3.4.1 AXENISCHE KLEEPFLANZEN 71
3.4.2 REISOLIERTE PILZSTAEMME 71
3.5 NACHWEIS VON ENDOPHYTEN IM WEISSKLEE 72
3.5.1 ENDOPHYTEN IN APOPLASTENFLUESSIGKEIT 72
3.5.2 DURCHLICHTMIKROSKOPISCHER NACHWEIS 73
3.5.2.1 ANILINBLAUFAERBUNG 73
3.5.2.2 EPIDERMISPRAEPARATION 73
3.5.2.3 GEWEBEDUENNSCHNITTE 73
3.5.3 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHER NACHWEIS 74
3.5.3.1 DAPI 74
3.5.3.2 FDA 74
3.5.3.3 BASISCHES ANILINBLAU 75
4 DISKUSSION 80
4.1 ZUR ISOLIERBARKEIT VON ENDOPHYTEN 80
4.2 IDENTIFIZIEREN VON ENDOPHYTEN UND IHRE ROLLE IM WIRT 83 4.2.1
EPIPHYT, PATHOGEN, ENDOPHYT? 83
4.2.2 MYCELPILZE 84
4.2.3 HEFEPILZE 86
4.3 TAXONOMIE ENDOPHYTISCHER HEFEN 89
4.3.1 EINORDNUNG NACH MORPHO- UND PHYSIOLOGISCHEN MERKMALEN 90 4.3.2
EINORDNUNG NACH MOLEKULAREN MERKMALEN 93
4.3.2.1 PCR-RFLP 94
4.3.2.2 RAPD 97
4.3.3 KLASSIK UND MODERNE KOMBINIERT 99
4.4 NACHWEISE, ENDOPHYTEN IM PFLANZENINNEREN 103
4.4.1 WIE GELANGEN HEFEN IN PFLANZEN? 104
4.4.2 MIKROSKOPIE 105
4.5 AUSBLICK 108
5 ZUSAMMENFASSUNG 110
6 SUMMARY 112
LITERATURVERZEICHNIS 114
A ANHANG 132
A.L LOESUNGEN UND MEDIEN 132
A.L.L REAKTIONSLOESUNGEN 132
A.L.1.1 PUFFERLOESUNGEN 132
A.L.1.2 FARBSTOFFLOESUNGEN 133
A.L.1.3 WEITERE LOESUNGEN 134
A.L.2 NAEHRMEDIEN 135
A.2 PHYSIOLOGISCHE MERKMALE FUER REFERENZSTAEMME 138
INDEX 141
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