Klonierung und molekulargenetische Charakterisierung des R5-Proteins von Streptococcus agalactiae (GBS):
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
A
EINLEITUNG
.
.3
1.
EINORDNUNG
DER
STREPTOKOKKEN
IN
DAS
SYSTEM
DER
PROKARYONTEN
.
3
2.
KLASSIFIZIERUNG
DER
STREPTOKOKKEN
.
3
3.
GRUPPE
B
STREPTOKOKKEN
(GBS)
.
5
4.
VON
STREPTOCOCCUS
AGALACTIAE
VERURSACHTE
ERKRANKUNGEN
.
5
5.
ZIELE
DER
VORLIEGENDEN
PROMOTIONSARBEIT
.
7
B
MATERIAL
UND
METHODEN
.
9
1.
BAKTERIEN
.
9
1.1
BAKTERIENSTAEMME
.
9
1.2
STAMMHALTUNG
.
11
1.3
WACHSTUMSMEDIEN
.
12
1.4
SDS-LYSATE
VON
STREPTOKOKKEN
.
12
2.
PLASMIDE
UND
BAKTERIOPHAGEN
.
13
3.
ANTIBIOTIKAKONZENTRATIONEN
.
13
4.
PRIMER
FUER
FUSIONSPROTEINE
UND
GENSONDEN
.
13
5.
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
KITS
UND
ANDERE
BIOMOLEKUELE
.
15
6.
PUFFER
UND
ANDERE
LOESUNGEN
.
17
7.1
RESTRIKTIONSVERDAU
.
20
7.2
LIGATION
.
21
7.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
MIT
ALKALISCHER
LYSE
.
21
7.4
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
STREPTOKOKKEN
.
22
7.5
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
.
23
8.
DNA-HYBRIDISIERUNGSEXPERIMENTE
.
24
8.1
MARKIERUNG
DER
DNA
MIT
DIGOXYGENIN-DUTP
.
25
8.2
SOUTHERNBLOTTING
.
25
8.3
DOT-BLOT-SOUTHEMBLOTTING
.
26
9.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
27
9.1
"
TAQ
CYCLE"-SEQUENZIERUNG
MIT
"DYE
DEOXY"-TERMINATOREN
.
27
9.2
AUFREINIGUNG
DER
SEQUENZIERPROBEN
.
28
9.3
AUSWERTUNG
DER
DATEN
.
29
10.
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
29
10.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
29
10.2
ELEKTROPHORESE
IN
DISKONTINUIERLICHEN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
.
30
11.
WESTERN-BLOT
.
31
11.1
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
MEMBRANGEBUNDENER
PROTEINE
.
32
12.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
R5-GENS
IN
COLI
.
33
12.1
SCHNELLTEST
AUF
EXPRESSION
DES
R5-GENS
IN
E.
COLI
.
33
12.2
NACHWEIS
IM
KOLONIELIFT/PLAQUELIFT
.
33
13.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/I-ZELLEN
.
34
13.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/I-ZELLEN
FUER
DIE
ELEKTROPORATION
.
34
14.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
35
14.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
35
15.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
35
15.1
AUFREINIGUNG
VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
FUSIONSPROTEINEN
.
36
15.2
NATIVE
AUFFEINIGUNG
VON
HIS-TAG
FUSIONSPROTEINEN
.
36
16.
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
SEREN
.
36
17.
IMMUNISIERUNGSVERSUCHE
MIT
MAEUSEN
.
37
17.1
NASALE
UND
INTRAPERITONEALE
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
MIT
GST-FUSIONSPROTEIN
.
37
17.2
GEWINNUNG
DER
MAEUSESEREN
.
38
17.3
GEWINNUNG
DER
LUNGENLAVAGE
.
38
17.4
BESTIMMUG
DER
HUMORALEN
IMMUNANTWORT
MITTELS
ELISA
.
39
18.
ERSTELLUNG
EINER
GENBANK
VOM
STAMM
NCTC
09828
IN
COLI
MIT
DEM
X-ZAP-EXPRESS
VEKTORSYSTEM
.
;
.
40
18.1
GROESSENFRAGMENTIERUNG
MITTELS
NACL-GRADIENTEN
.
41
18.2
PRAEPARATION
DER
X-ARME
UND
LIGATION
.
42
18.3
VERPACKUNG
DES
LIGATIONSMIX
IN
X-PARTIKEL
.
42
18.4
BESTIMMUNG
DES
PHAGENTITERS
UND
DER
VERPACKUNGSEFFIZIENZ
.
43
18.5
SCREENING
DER
GENBANK
MITTELS
WESTERN-BLOT
.
43
18.6
IN
VIVO-EXZISION
.
44
C
ERGEBNISSE
.
46
1.
CHARAKTERISIERUNG
UND
STRUKTURELLE
UNTERSUCHUNG
DES
R5
GENS/PROTEINS
.
46
1.1
KARTIERUNG
DER
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
DER
KLONE
PSEL,
PSE2
UND
PSE3
.
46
1.2
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE
DES
INSERTS
VOM
KLON
PSE3
.
46
1.3
NUKLEOTID
UND
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
INSERTS
VOM
KLON
PSE3
UND
LOKALISATION
DES
R5-GENS
.
48
1.4
SEQUENZHOMOLOGIEN
DES
R5-GENS/PROTEINS
ZU
BEKANNTEN
GENEN
UND
PROTEINEN
.
51
1.4.1
SEQUENZHOMOLOGIE
DER
SIGNALSEQUENZ
.
57
1.4.2
SEQUENZHOMOLOGIE
DES
MEMBRANANKERS
.
58
2.
EPIDEMIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
VERBREITUNG
DES
R5-GENS
BEI
GBS
.
.
59
2.1
ERGEBNISSE
DES
SCREENINGS
VON
HUMANEN
GBS-ISOLATEN
.
59
2.2
ERGEBNISSE
DES
SCREENINGS
VON
GBS
TIERISOLATEN
.
60
2.3
SOUTHEMBLOTS
MIT
DEN
GENSONDEN
.
61
2.4
WESTEMBLOTS
MIT
DEM
POLYKLONALEN
ANTIKOERPER
GEGEN
DAS
REKOMBINANTE
R5-PROTEIN
65
3.
IMMUNANTWORT
GEGEN
DAS
REKOMBINANTE
R5-PROTEIN
IN
DER
MAUS
.
70
D
DISKUSSION
.
.
.
72
E
LITERATUR
.
78
F
ANHANG
.
86
I
VEKTORKARTEN
.
86
II
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
89 |
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