Das regA-Gen von Volvox carteri: Elemente der Genregulation und Zielgene der RegA-kontrollierten Differenzierung
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INHALTSVERZEICHNIS
II
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
7
2.1
CHEMIKALIEN
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
REAGENZIEN
.
7
2.1.1
FEINCHEMIKALIEN
.
7
2.1.2
ENZYME
UND
KIT-SYSTEME
.
7
2.1.3
ANTIKOERPER
.
8
2.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
8
2.3
OLIGONUKLEOTIDE
.
14
2.4
VEKTOREN
.
17
2.5
ORGANISMEN
.
19
2.6
KULTIVIERUNG
VON
ORGANISMEN
.
22
2.6.1
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
E.
COLI
.
22
2.6.2
FBZVOX-KULTURMEDIEN.
23
2.6.3
KO/VOX-KULTURHALTUNG
.
24
2.7
TRANSFORMATION
VON
VOLVOX
CARTERI
.
24
2.8
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
DNA
.
24
2.9
AMPLIFIKATION
VON
DNA
UND
RNA
MITTELS
PCR-TECHNIK
.
24
2.10
GELELEKTROPHORESE
.
25
2.10.1
AGAROSE-GELE
.
25
2
10.2
ACRYLAMID-GELE
.
26
2.11
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
26
2.12
KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
26
2.12.1
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
26
2.12.2
LIGIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
27
2.12.3
TRANSFORMATION
VON
.
COLI
.
ZI
2.13
GEWINNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
AUS
ORGANISMEN
.
28
2.13.1
DNA-ISOLIERUNGAUS
V.
CARTERI
.
28
2.13.1.1
DNA-GEWINNUNG
IM
KLEINEN
MASSSTAB
.
28
2.13.1.2
CTAB-METHODE
.
28
2.13.1.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
MITTELS
CSCL-GRADIENTEN
.
29
2.13.2
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
V.
CARTERI
.
29
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.13.3
PLASMID-DNA-GEWINNUNG
AUS
E.
COLI
.
29
2.13.3.1
MINI-PRAEPARATIONEN
.
29
2.13.3.2
GEWINNUNG
VON
GROESSEREN
MENGEN
PLASMID
AUS
E.
COLI
.
30
2.13.4
PROTEIN-ISOLIERUNG
AUS
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII
.
30
2.13.4.1
DENATURIERENDE
PROTEINEXTRAKTION
FUER
DEN
WESTERN
BLOT
.
30
2.13.4.2
GEWINNUNG
NATIVEN
PROTEINEXTRAKTS
.
30
2.14
TRANSFERTECHNIKEN,
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN.
31
2.14.1
SOUTHERN
UND
NORTHERN
BLOT
.
31
2.14.2
WESTERN
BLOT
.
31
2.15
DNA-SEQUENZANALYSEN
UND
AUSWERTUNGSVERFAHREN
.
32
2.16
ANALYSE
VON
PROTEIN-RNA-WECHSELWIRKUNGEN
.
32
2.16.1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
32
2.16.2
RNA-EMSA
.
33
2.17
AUTORADIOGRAPHIE
.
33
3.
ERGEBNISSE
.
34
3.1
MOLEKULARE
CHARAKTERISIERUNG
DES
REG4-GENS
UND
SEINES
PRODUKTS
REGA
.
35
3.1.1
SEQUENZANALYSE
DES
REGA-GMS
AUS
V.
CARTERI
F.
NAGARIENSIS
.
35
3.1.2
EIGENSCHAFTEN
DES
ABGELEITETEN
REGA-GENPRODUKTS
.
42
3.1.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
REGA-MUTANTENALLELS
VON
V.
CARTERI
153-68
.
44
3.1.4
KOMPLEMENTATION
DER
REGA-MUTATION
MIT
REGA
-PLASMID-KONSTRUKTEN
.
47
3.2
REGULATION
DER
REGA
-GENEXPRESSION
.
51
3.2.1
ANALYSE
DER
REGA-MRNA
UND
REGA-EXPRESSION
.
51
3.2.2
"REARRANGEMENF
1
-HYPOTHESE
.
53
3.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
REGA
-PROMOTORS
.
54
3.2.4
WEITERE
TRAE-REGULATORISCHE
ELEMENTE
IM
REGA-GERDOCUS
.
56
3.2.4.1
3
'-BEREICH
DES
REGA
-GENS
.
56
3.2.4.2
INTRONS
.
57
3.2.5
UEBEREXPRESSION
VON
REGA
IN
DEN
SOMATISCHEN
UND
REPRODUKTIVEN
ZELLEN
.
60
3.2.6
WECHSELWIRKUNGEN
VON
PROTEINEN
MIT
DER
3-NTR
DES
REG4-TRANSKRIPTS
.
63
3.3
ZIELGENE
DER
REGA-REGULATION
.
68
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.
DISKUSSION
.
73
4.1
STRUKTUR
UND
REGULATION
DES
REGA-GENS
.
73
4.2
IST
REGA
EIN
TRANSKRIPTIONSREPRESSOR?
.
79
4.3
WELCHES
SIND
DIE
ZIELGENE
DER
REGA-KONTROLLE?
.
81
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
86
6.
LITERATUR.
88 |
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