Funktionelle und biochemische Analyse des Hitzeschockproteins HifA aus Bacillus subtilis:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
HITZESCHOCKPROTEINE
.
1
1.1.1
DIE
HSPIOO-FAMILIE
.
1
1.1.2
DIE
HSP90-FAMILIE
.4
1.1.3
DIE
HSP70-FAMILIE
.
5
1.1.4
DIE
HSP60-FAMILIE
.
7
1.2
HITZESCHOCKPROTEINE
ALS
REGULATOREN
DER
HITZESCHOCKANTWORT
.8
1
2.1
DNAK:
DER
SENSOR
IN
E.
COLI
.
8
1.2.2
DER
HITZE-SENSOR
IN
SS.
SUBTILIS
.
9
1.2.3
DER
EUKARYONTISCHE
HITZESCHOCKFAKTOR
HSF
.
10
1.3
DAS
HITZEINDUZIERTE
GEN
HLFA
.
11
2
ERGEBNISSE
.
14
2.1
RECHNERUNTERSTUETZTE
SEQUENZANALYSE
VON
HLFA
.
14
2.2
REINIGUNG
VON
HLFA
.
19
2.2.1
UEBERPRODUKTION
VON
HIFA
IN
E.
COLI
BL21(DE3)/PETIPA43
.
19
2.2.2
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
VON
HIFA
.
20
2.2.3
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
21
2.2.4
GELFILTRATION
.22
2.2.5
AKTIVITAETSTESTS
ZU
DEN
VERSCHIEDENEN
AUFREINIGUNGSSCHRITTEN
.23
2.3
IDENTIFIZIERUNG
DES
KOFAKTORS
.24
2.4
DIE
ENZYMATISCHE
AKTIVITAET
VON
HIFA
.
25
.
2.4.1
BESTIMMUNG
KINETISCHER
PARAMETER
.25
2.4.2
NACHWEIS
DES
ELEKTRONENTRANSFERS
AUF
FMN
.27
2.4.3
NAD
+
ALS
ELEKTRONENAKZEPTOR
.
28
2.4.4
BESTIMMUNG
DES
REDOXPOTENTIALS
.28
2.4.5
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DER
HIFA-ENZYMAKTIVITAET
.30
2.5
STABILITAET
DES
HLFA
PROTEINS
.
31
2.5.1
STABILITAET
VON
HIFA
BEI
50C
.
31
2.5.2
HAMSTOFF-INDUZIERTE
DENATURIERUNG
VON
HIFA
.
32
2.6
EXPRESSION
VON
HIFA
.34
2.6.1
EXPRESSION
VON
HIFA
UNTER
HITZESTRESSBEDINGUNGEN
.
34
2.6.2
EXPRESSION
VON
HIFA
IN
GEGENWART
VON
ETHIDIUMBROMID
.35
2.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
HIM-MUTANTE
.36
2.7.1
WACHSTUM
VON
B.
SUBTILIS
IPA17N
.
36
2.7.2
TOLERANZ
GEGENUEBER
STRESSBEDINGUNGEN
.
39
3
DISKUSSION
.
42
3.1
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
HIFA
.42
3.1.1
DER
KOFAKTOR
VON
HIFA
.42
3.1.2
HIFA
IST
EINE
NADPH:FLAVIN
OXIDOREDUKTASE
.43
3.2
HIFA
IST
EIN
MITGLIED
EINER
NEUARTIGEN
PROTELNFAMLLLE
.44
3.3
DIE
FUNKTION
VON
HIFA
IN
DER
ZELLE
.47
3.3.1
HIFA
IST NICHT
ESSENTIELL
FUER
DAS
WACHSTUM
VON
B.
SUBTILIS
.48
3.3.2
HIFA-PARALOGE
IN
B.
SUBTILIS
.48
3.3.3
WACHSTUM
DER
HIFA-MUTANTE
.49
3.3.4
DIE
ROLLE
VON
HIFA
UNTER
STRESSBEDINGUNGEN
.
50
3.3.5
HIFA
UND
YWCH
.
53
3.4
FAZIT
.
54
4
PLASMID-
UND
STAMMKONSTRUKTIONEN
.
42
4.1
KONSTRUKTION
DES
UEBEREXPRESSIONSVEKTORS
PETIPA43
.
56
4.2
KONSTRUKTION
VON
PLPA17N
.
56
4.3
KONSTRUKTION
DES
STAMMES
B.
SUBTILIS
IPA17N
.
57
4.3.1
UEBERPRUEFUNG
DURCH
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
58
4
3.2
UEBERPRUEFUNG
VON
B.
SUBTILIS
IPA17N
DURCH
IMMUNOBLOT
.
58
5
MATERIAL
UND
METHODEN
.
61
5.1
MATERIALIEN
.
61
5.2
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
.
64
5.3
PUFFER,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
65
5.3.1
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
66
5.3.2
PUFFER
FUER
CHROMATOGRAPHIEN
.66
5.3.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
DNA-GELELEKTROPHORESE
.66
5.3.4
GROESSENSTANDARDS
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
67
5.3.5
BAKTERIENNAEHRMEDIEN
.67
5.3.6
ANTIBIOTIKA
UND
ANDERE
ZUSAETZE
.69
5.4
METHODEN
.
69
5.4.1
ALLGEMEINE
METHODEN
.69
5.4.2
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
71
5.4.3
METHODEN
ZUR
PROTEINREINIGUNG
UND
-CHARAKTERISIERUNG
.
72
5.4.4
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.77
5.4.5
METHODEN
MIT
DESOXYRIBONUKLEINSAEUREN
.
79
6
LITERATUR
.
80 |
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