Diagnose und Therapie von Funktionsstörungen menschlicher Leukozyten nach Bestrahlung: Abschlußbericht zum Forschungsvorhaben BMVg InSan I 11Z1-S-389197
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Seite
Inhaltsverzeichnis ^V
Verzeichnis der Abkürzungen VIII
1. Einleitung 1
1.0 Prolog !
1.1 Die respiratory bursf -Funktion der Phagozyten 2
1.1.1 Historie 2
1.1.2 Grundzüge der unspezifischen Immunabwehr 3
1.1.3 Vorkommen und Biochemie der respiratory bursf -Reaktion 4
1.1.4 Die Auslösung der respiratory bursf -Reaktion
(intrazelluläre Signalübertragung) V
1.1.5 Pathophysiologie der respiratory bursf -Reaktion 13
1.2. Das HL-60 Modell 14
1.3 Strahlenwirkung auf Elemente der intrazellulären Signaltransduktion 16
1.4 Fragestellung 18
2. Material und Methoden 21
2.1 Bezugsquellen für Reagenzien 21
2.1.1 Zusammensetzung der gebräuchlichsten Pufferlösungen: 22
2.1.2 Verzeichnis der eingesetzten Inhibitoren mit Lösungsmitteln
und Konzentrationen der Stammlösungen 24
2.2 Zellen 25
2.2.1 Blutzellen 25
2.2.2 HL-60 Zellinie 25
2.3 Röntgenbestrahlung 26
2.4 Wachstumskurve und Überleben nach Bestrahlung ( Klonierungstesf ) 26
2.5 Präparation von Granulozyten aus Vollblut 26
2.6 Vitalitätstestung 27
2.7 Funktionelle Untersuchungen 27
2.7.1 Messung der respiratory bursf -Reaktion 27
2.7.1.1 Durchflußzytometrischer Test 28
2.7.1.2 Chemolumineszenz-Assay 29
2.7.1.3 Nitroblau-Tetrazolium Reduktionstest 29
2.7.1.4 Herstellung von Immunkomplexen 29
Seite
2.7.2 Phagozytose-Test 30
2.8 Immunphänotypisierung 30
2.8.1 Expression von CD-Antigenen 30
2.8.2 Expression des Formylpeptid-Rezeptors (FPR) 31
2.8.3 Markierung von intrazellulären Phosphotyrosinresten an Proteinen 31
2.8.4 Darstellung des filamentären Actins des Zytoskeletts 32
2.9 Durchflußzytometrie 32
2.10 RNA-Isolierung und Northern blot 33
2.11 Immunpräzipitation und Western blot von Proteinen 34
2.12 Proteinkinase C (PKC)-Aktivitätsassay 36
2.13 Lipidextraktion 3 7
2.14 HPLC- Analyse 37
2.15 Biochemisch-fluorometrischer Nachweis von H2O2 38
2.16 Statistik 38
3. Ergebnisse 39
3.1 Strahlenbiologische, immunphänotypische und funktionelle
Charakterisierung des HL-60 Modells 39
3.1.1 Zeilproliferation, Differenzierung und Überleben nach Bestrahlung 39
3.1.2 Phänotypische Veränderungen unter Differenzierung
und/oder Bestrahlung 41
3.1.3 Funktionelle Reifung unter Differenzierung und/oder Bestrahlung 44
3.1.3.1 Ausstattung von Granulozyten und HL-60 Zellen mit
antioxidativen Mechanismen 49
3.1.4 Veränderungen von PKC-Isoenzym-Mustem nach Differenzierung
und/oder Bestrahlung 50
3.1.5 Veränderung der PKC-Aktivität unter Differenzierung
und/oder Bestrahlung 52
3.1.6 Veränderung des F-Actins des Zytoskelettes unter Differenzierung
und Bestrahlung 55
3.2 Signaltransduktionswege zur Auslösung der respiratory burst -Aktivität
und ihre Strahlensensitivität 59
3.2.1 Allgemeines zu Strahleneffekten 60
3.2.2 Respiratory bursf -Oxidase 61
3.2.3 Protein Kinase C-Aktivität 63
3.2.3.1 Strahleneffekte auf Reaktionswege mit direkter PKC-Aktivierung
durch PMA 65
Seite
3.2.4 Phospholipasen 66
3.2.4.1 Phospholipasen C 66
3.2.4.1.1 Phosphatidylinositol-abhängige Phospholipase C (Ptdlns-PLC) 67
3.2.4.1.2 Phosphatidylcholin-abhängige Phospholipase C (PtdCho-PLC) 68
3.2.4.2 Phospholipase A2 69
3.2.5 Protein-Tyrosin-Kinase- und -Phosphatase-Aktivitäten 70
3.2.5.1 Protein-Tyrosin-Kinase-Aktivität und respiratory burst 72
3.2.5.2 Protein-(Tyrosin)-Phosphatase-Aktivitätund respiratory burst 74
3.2.6 Phosphatidylinositol 3-Kinase-Aktivität und respiratory burst 76
3.2.7 PTK-neben PI3-Kinase-Aktivität und respiratory burst 81
3.2.8 Diacylglycerin-Kinase/Phosphatidyl-Phosphohydrolase
und respiratory burst 82
3.3 Strahleneffekte auf Lipidmetabolite als 2nd messenger
der Signaltransduktion 86
4. Diskussion 90
4.1 Diskussion des HL-60 Modells 91
4.1.1 Diskussion des Promyelozyten-/Progenitor-Status der HL-60 Zellen 91
4.1.2 Diskussion der immunphänotypischen Veränderungen induzierter
und bestrahlter HL-60 Zellen 92
4.1.3 Diskussion der funktionellen Veränderungen induzierter und
bestrahlter HL-60 Zellen 95
4.1.4 Diskussion der Veränderungen des Zytoskeletts induzierter und
bestrahlter HL-60 Zellen 96
4.2 Diskussion der Signalübertragung zur Aktivierung des respiratory burst 100
4.2.1 Methodische Aspekte 100
4.2.2 Diskussion der verwendeten Stimuli des respiratory burst 102
4.2.3 Diskussion der Beteiligung von Elementen der intrazellulären
Signalübertragung bei der Auslösung der respiratory bursf -Reaktion
und ihre Strahlenempfindlichkeit 103
4.2.3.1 PMA- und f-MLP-induzierte Aktivierung der respiratory bursf -Oxidase 104
4.2.3.1.1 Bedeutung der Proteinkinasen C (Vorkommen von Isoenzymen,
Aktivität, Translokation, Strahlenempfindlichkeit) 104
4.2.3.1.2 Bedeutung der Ptdlns-Phospholipasen C 108
4.2.3.1.3 Bedeutung der Phospholipase A2 und von Arachidonsäure 109
4.2.3.1.4 Bedeutung von Protein-Tyrosinkinasen, -Phosphatasen, Phospholipase D
und Phosphatidylinositol 3-Kinase 113
Seite
4.2.3.1.5 Bedeutung von Phosphatidyl-Phosphohydrolase 119
4.2.3.1.6 Bedeutung von Diacylglycerin-Kinase 120
4.23.1.1 Bedeutung von PtdCho-Phospholipase C 121
4.2.3.2 Fcy-Rezeptor-induzierte Aktivierung der respiratory bursf -Oxidase 122
4.2.3.2.1 Signaltransduktion durch Fcy-Rezeptoren 122
4.2.3.2.2 Bedeutung von Protein-Tyrosinkinasen und Phospholipase A2 124
4.2.3.2.3 Bedeutung von Proteinkinasen C, Phospholipase C
und Phosphatidylinositol 3-Kinase 125
4.3 Zusammenfassung der diskutierten Signaltransduktionswege 126
4.4 Diskussion der Strahleneffekte auf die Signalübertragung 128
4.5 Ausblick 132
4.5.1 Phosphatidylinositol 3-Kinase - ein neues Zentrum strahlenbiologischer
Forschung? 132
4.5.2 Bedeutung der Kenntnisse über die Strahlenempfindlichkeit PKC
für zukünftige Therapieansätze 135
5. Zusammenfassung 137
6. Literatur 140
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