Isolierung und Charakterisierung des pin1-Gens von Arabidopsis thaliana L.: eine mutmaßliche Schlüsselkomponente des polaren Auxintransports
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| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
1999
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Hohenheim, Univ., Diss., 1998 |
| Physical Description: | XIV, 178 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVEIZEICHNIS.
XI
1
EINLEITUNG.!
1.1
PFLANZENENTWICKLUNG
UND
PHYTOHORMONE
.
1
13
DAS
PHYTOHORMON
AUXIN
.
3
13
DER
POLARE
AUXINTRANSPORT
.
6
1.4
DER
AUXINEFLLUX-CARRIER
.
8
13
AUXINTRANSPORT
UND
POLARE
PFLANZENENTWICKLUNG
.
11
1.6
MOLEKULARE
ANALYSE
DES
POLAREN
AUXINTRANSPORTS
.
14
1.7
PINL-MUTANTEN
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
17
13
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
20
2
MATERIAL
UND
METHODEN.
21
2.1
MATERIAL
.
21
2.1.1
PFLANZEN
.
21
2.1.2
HEFE
.
21
2.1.3
BAKTERIEN
.
21
2.1.4
BAKTERIOPHAGEN
.
22
2.1.5
PLASMIDE
.
22
2.1.6
NUCLEINSAEURE-BIBLIOTHEKEN
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA.
.
22
2.1.7
ENZYME
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
AGENZIEN
.
22
2.1.8
SONSTIGE
CHEMIKALIEN
.
23
2.1.9
SYNTHETISCHE
OLIGONUCLEOTIDE
.
26
2.1.10
WEITERE
MATERIALIEN
.
27
2.1.11
SAEULEN
UND
SAEULENMATERIAL
.
28
2.1.12
GERAETE
.
28
2.1.13
DATENVERARBEITUNG
.
29
2.1.14
KULTURMEDIEN
.
30
2.1.14.1
BAKTERIEN
UND
PHAGENMEDIEN
.
30
2.1.14.2
HEFEMEDIUM.
30
2.1.14.3
PFLANZENMEDIEN
.
30
2.1.15
ANTIBIOTIKA,
HORMONE
UND
ANDERE
STAMMLOESUNGEN
.
31
2.2
METHODEN
.
32
2.2.1
DNA-PRUEPARATIONEN
.
32
2.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
.
32
2.2.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
NACH
DER
YYBOILING
RNETHOD
"
.
.
32
2.2.2.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
MIT
DEM
QUIAGEN-KIT
.
32
2.2.1.2
PRAEPARATION
VON
PHAGEN-DNA
.
32
2.2.1.2.1
DNA-ISOLIERUNG
AUS
LAMBDA-PHAGEN
DURCH
PLATTENLYSE
.
33
2.2.1.2.2
DNA-ISOLIERUNG
AUS
LAMBDA-PHAGEN
DURCH
FLUESSIGLYSE
.
34
2.2.1.2.2.1
HERSTELLUNG
EINES
PHAGENKLEINLYSATES
.
34
2.2.1.2.2.2
MINI-PRAEPARATION
VON
PHAGEN-DNA
.
34
2.2.1.2.2.3
MAXI-PRAEPARATION
VON
PHAGEN-DNA
.
34
2.2.1.2.2.4
PRAEPARATION
VON
PHAGEN-DNA
MIT
DEM
QUIAGEN-KIT
(MIDI-PRAEPARATION)
.
35
2.2.1.3
DNA-ISOLIERUNG
AUS
HEFE
.
36
2.2.1.4
DNA-ISOLIERUNG
AUS
PFLANZEN
.
36
2.2.1.4.1
PRAEPARATION
GENOMISCHER
PFLANZEN-DNA
(YYCTAB-METHODE
"
)
.
36
2.2.1.4.2
SCHNELLPRAEPARATION
GENOMISCHER
PFLANZEN-DNA
.
37
2.2.1.5
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
37
2.2.2
PROTEINPRAEPARATIONEN
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
37
2.2.2.1
SCHNELLPRAEPARATION
VON
GESAMTPROTEINEN
.
37
2.2.2.2
PRAEPARATION
VON
MIKROSOMEN
UND
PLASMAMEMBRANEN
.
38
2.2.3
METHODEN
ZUR
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
39
2.2.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUCLEINSAEURELOESUNGEN
.
39
2.2.3.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
39
2.2.3.2.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
39
2.23.2.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
.
39
2.2.4
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
NUDEINSAEUREN
.
40
2.2.4.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
40
2.2.4.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
40
2.2.4.3
AUFIULLREAKTION
MIT
DNA-POLYMERASE
I
(KLENOW-FRAGMENT)
.
41
2.2.4.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
41
2.2.4.5
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
(YYRANDOM
PRIME
LABELING
"
)
.
41
2.2.4.6
SYNTHESE
DIGOXIGENIN-MARKIERTER
RNA-SONDEN.
.
42
2.2.4.7
ERZEUGUNG
VON
EXONUCLEASE
III-DELETIONSKLONEN
.
42
2.2.4.8
SEQUENZIERUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
.
43
2.2.4.8.
1
AUTOMATISIERTE
VERFAHREN
ZUR
DNA-SEQUENZIERUNG.
.
43
2.2.4.8.2
MANUELLE
ZYKLISCHE
SEQUENZIERUNG
DES
PCR-PRODUKTES
LR26-EN48R.
.
44
2.2.4.9
POLYMERASEKETTENREAKTION.
45
2.2.5
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
MIT
PLASMID-DNA
.
45
2.2.5.1
PRAEPARATION
HITZESCHOCK-KOMPETENTER
ESCHERICHIA
COLI
.
45
2.2.5.2
HITZESCHOCK-TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN.
46
2.2.5.3
PRAEPARATION
ELEKTROKOMPETENTER
ESCHERICHIA
COLI
.
46
2.2.5.4
ELEKTROPORATION
KWAPEAEXAER
ESCHERICHIA
COLI
.
46
2.2.6
GELELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
46
2.2.6.1
AUFTRENNUNG
UND
NACHWEIS
VON
DNA-BANDEN
IN
AGAROSEGELEN.
.
46
2.2.6.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-BANDEN
AUS
AGAROSEGELEN.
47
2.2.6.3
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
RNA
.
47
2.2.6.4
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IM
POLYACRYLAMIDGEL
.
47
VI
2.2.6.5
AUFTRENNUNG
VON
PROTONEN
IM
SDS-POLYACRYLAMIDGEL
UND
COOMASSIE-FAETBUNG.
.
48
2X7
BLOTTCN
VON
NUCLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
.
49
2.2.7.1
SOUTHEM-BLOTTING
.
49
2.2.7.2
PHAGENPLAQUE-BIOTTING.
50
2.2.7.3
NORTHEM-BLOTTING.
.
50
2.2.7.4
WESTEM-BLOTTING.
.
51
2.2.7.5
PONCEAU-FAERBUNG.
.
51
2X8
SPEZIFISCHE
DETEKTION
MEMBRANGEBUNDENER
NUCLEINSAEUREN
UND
PROTEINE
.
51
2.2.8.1
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG.
51
2.2.8.2
PHAGENPLAQUE-BLOT-HYBRIDISIERUNG.
.
52
2.2.8.3
HYBRIDISIERUNG
DER
CIC
YAC-GENOMBIBLIOTHEK.
52
2.2.8.4
NORTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG.
52
2.2.8.5 IMMUNFARBUNG
VON
WESTEM-BLOTS
.
52
2.2.9
SPEZIFISCHE
DETEKTION
VON
NUCLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
IN
GEWEBESCHNITTEN
.
54
2.2.9.1
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
.
54
2.2.9.1.1
PRAEPARATION
VON
GEWEBESCHNITTEN.
54
2.2.9.1.2
IN-SITU-HYBRIDISIENING
MIT
DIGOXIGENIN-MAIKIERTEN
RNA-SONDEN
.
54
2.2.9.2
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
.
55
2.2.92.
1
PRAEPARATION
VON
GEWEBESCHNITTEN
ZUR
IMMUNLOKALISIERUNG
VON
ATPINL
.
55
2.2.92.2
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
IN
GEWEBESCHNITTEN.
55
2X10
TRANSPOSON
INSERTION
DISPLAY-METHODE
.
56
2X11
HERSTELLUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
POLYKLONALEN
ANTI-ATPINL-ANTIKOERPER.
.
59
2X12
KULTIVIERUNG
VON
ARAOEUEFCPSUE
THO&INA.
60
2.2.12.1
KULTUR
IM
GEWAECHSHAUS,
KREUZUNGEN
UND
SAMENGEWINNUNG
.
60
2.2.12.2
IN-VITRO-KULTUR
.
61
2.2.12.2.1
OBERFLAECHENSTERILISATION
VON
SAMEN.
61
2.2.12.2.2
FESTMEDIUMKULTUR.
61
2.2.12.2.3
FLUESSIGMEDIUMKULTUR
.
61
2.2.12.2.4
KALLUSSUSPENSIONSKULTUR
.
61
3
ERGEBNISSE.
62
3.1
ENTSTEHUNG DER
PINL.-.-EN-MUTANTEN
.
62
32
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER/VNL.-.'N-MUTANTEN
.
65
3
2
GENETISCHE
ANALYSE
DERPINL.'.'EN-MUTANTEN
.
66
3.3.1
MENDELSCHE
VERERBUNG
DER
PINL::ENI34
UNDPTN7:.-H349-MUTATIONEN
.
68
3.3.2
ALLELISCHER
TEST
DER
MUTANTEN
PINL::EN!34
UND
PINL::EN349
.
69
3.3.3
ALLELISCHER
TEST
DER
MUTANTEN
PINL::ENL34
UND
PIN-FORMED.
.
70
3.4
SOUTHERN-BLOT-ANALYSE
DER
TRANSPOSONEN
IN
PINL::ENL34-MUTANTEN
.
71
3.5
ISOLIERUNG
DER
TRANSPOSONFLANKIERENDEN
DNA
AUS
PINL::ENL34
.
74
3.5.1
SOUTHERN-BLOT-ANALYSE
MIT
CSP61-GESPALTENER
GENOMISCHER
DNA
.
74
3.5.2
KLONIERUNG
DER
TRANSPOSONFLANKIERENDEN
GENOMISCHEN
DNA
.
75
3.5.3
SOUTHERN-BLOT-ANALYSE
DER
KLONIERTEN
TRANSPOSONFLANKIERENDEN
DNA
.
77
3.5.4
SEQUENZIERUNG
DER
KLONIERTEN
TRANSPOSONFLANKIERENDEN
DNA
.
79
VU
3.6
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
4RPZA'7-CDNA
.
80
3.6.1
ISOLIERUNG
DER
ATPINL-CDNA
.
80
3.6.2
SEQUENZIERUNG
DER^TFWZ-CDNA-KLONE
.
82
3.6.3
ANALYSE
DER
ATPINL-CDNA
.
84
3.6.4
DIE
TW-GENFAMILIE
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
UND
ANDEREN
PFLANZENARTEN
.
86
3.7
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
GENOMISCHEN
ATPINL-DNA
.
87
3.7.1
ISOLIERUNG
EINES
GENOMISCHEN
ATPINL
-PHAGENKLONS
.
87
3.7.2
SEQUENZIERUNG
DES
ATPINL-GENS
.
88
3.7.3
ANALYSE
DER
GENOMISCHEN
-DNA-SEQUENZ
.
90
3.7.3.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
EXON-INTRON-STRUKTUR
.
90
3.7.3.2
DIE
PROMOTORREGION
DES
ATPINL-GENS
.
91
3.7.3.3
MOLEKULARE
ANALYSE
DER/WI7.:N-MUTANTEN
UND
REVERTANTEN
.
94
3.8
KARTIERUNG
DES
ATPINL-GENS
IM
GENOM
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
96
3.9
EXPRESSIONSANALYSE
DES
ATPINL-GENS
DURCH
RNA-HYBRIDISIERUNG
.
99
3.9.1
NORTHEM-BLOT-ANALYSEN
.
99
3.9.1.1
NACHWEIS
DER
ATPINL
-TRANSKRIPTE
IN
VERSCHIEDENEN
PFLANZENORGANEN
.
99
3.9.1.2
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
VON
WILDTYP
UND
PRN/-MUTANTEN
.
101
3.9.2
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
IN
STENGELQUERSCHNITTEN
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
102
3.10
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STRUKTUR
DES
ATPINL-PROTEINS
.103
3.10.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
ATPINL-AMINOSAEURESEQUENZ
.
103
3.10.2
HYDROPHILIZITAETSPLOT
DES
ATPINL-PROTEINS
.
104
3.10.3
BERECHNUNGEN
ZUR
MEMBRANTOPOLOGIE
DES
ATPINL-PROTEINS
.
105
3.10.4
POTENTIELLE
GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN
.
107
3.10.5
KONSERVIERUNG
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
VON
PIN-PROTEINEN
.
107
3.11
WESTERN-BLOT-ANALYSE
DES
ATPINL-PROTEINS
.110
3.11.1
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTI-ATPIN
1
-ANTIKOERPER
.
110
3.11.2
WESTERN-BLOT-ANALYSE
DER
POLYKLONALEN
ANTI-ATPINL-ANTIKOERPER
.
113
3.11.2.1
WESTERN-BLOT-ANALYSE
DER
POLYKLONALEN
ANTI-ATPINL-ANTISEREN
.
113
3.11.2.2
WESTERN-BLOT-ANALYSE
DER
AFFINITAETSGEREINIGTEN
ANTI-ATPINL-ANTIKOERPER
.
115
3.11.2.3
IMMUNDETEKTION
VON
ATPINL
IN
PFLANZLICHEN
GESAMTPROTEINPRAEPARATIONEN
.
116
3.11.2.4
IMMUNDETEKTION
VON
ATPINL
IN
PFLANZLICHEN
MIKROSOMEN.
.
118
3.11.2.5
KOMPETITION
DES
ATPIN
1
-PROTEINS
MIT
PIN
1
P-PROTEIN
.
119
3.12
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
DES
ATPINL-PROTEINS
.
121
3.12.1
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
ATPINL
IN
SUSPENSIONSZELLEN
.
121
3.12.2
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
ATPINL
IN
BLUETENSTANDACHSEN
.
122
3.12.2.1
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
ATPINL
IN
STENGELQUERSCHNITTEN
.
123
3.12.2.2
IMMUNCYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
ATPINL
IN
STENGELLAENGSSCHNITTEN
.
125
3.13
AUXINPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
PUELL-MUTANTEN
.127
3.13.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ANATOMIE
DER
BLUETENSTANDACHSE
.
127
3.13.2
UMERSUCHUNGEN
ZUR
AUXINSENSITIVITAET
DES
WURZELWACHSTUMS
.
128
3.13.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
GRAVITROPISCHEN
WURZELWACHSTUM.
.
130
3.13.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
AUXININDUZIERTEN
KALLUSWACHSTUM
.
131
VNI
4
DISKUSSION.
133
4.1
MOLEKULARE
ISOLIERUNG
DES
ATPINL-GENS
.
133
4.2
DIE
STRUKTUR
DES
ATPINL-GENS
.136
4.2.1
DIE
GRUNDLAGE:
ISOLIERUNG
DER
GENOMISCHEN
UND
CDNA
DES
ATPINL-GENS
.
136
4.2.2
TRANSKRIPTIONSSTART
DES
ATPINL-GENS
.
136
4.2.3
HOMOLOGE
PROMOTORELEMENTE
.
137
4.2.4
DIE
GENOMISCHE
EXON-INTRON-STRUKTUR.
.
138
4.2.5
POLYADENYLIERUNGSSIGNALE
DES
ATPINL-GENS
.
139
4.2.6
KONSERVIERTE
TRANSLATIONSSIGNALE
DEM/7W7-MRNA
.
139
43
CHARAKTERISIERUNG
DES
ATPINL-PROTEINS
.
140
4.3.1
ATPINL,
EIN
INTEGRALES
MEMBRANPROTEIN
DER
PLASMAMEMBRAN
.
140
4.3.2
HYPOTHETISCHES
MODELL
ZUR
MEMBRANTOPOLOGIE
.
142
4.3.3
STRUKTURELLE
AEHNLICHKEITEN
VON
ATPINL
MIT
PFLANZLICHEN
TRANSPORTPROTEINEN
.
144
4.3.4
KONSERVIERUNG
HOMOLOGER
PIN-PROTEINE
.
145
4.4
LOKALISIERUNG
DER
^/P/A7-GENPRODUKTE
IM
PFLANZLICHEN
LEITGEWEBE.
.146
4.4.1
DIE
SONDEN
ZUR
LOKALISIERUNG
DER
ATFW7-GENPRODUKTE
.
146
4.4.2
LOKALISIERUNG
DER
ATPINL
-EXPRESSION
IN
ORGANEN,
GEWEBEN
UND
ZELLEN
.
146
4.4.3
ASYMMETRISCHE
VERTEILUNG
DES
ATPINL-PROTEINS
IN
DER
PLASMAMEMBRAN
.
147
43
ATPINL-FUNKTION
UND
PFLANZLICHE
ENTWICKLUNG
.150
4.6
MODELL
ZUR
MOLEKULAREN
FUNKTION
DES
ATPINL-PROTEINS
.154
4.7
AUSBLICK
.
156
5
ZUSAMMENFASSUNG.
159
6
LITERATURVERZEICHNIS.
163
DANKSAGUNG
ERKLAERUNG
LEBENSLAUF
IX |
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