Die drei Pentonproteine des Hühneradenovirus Serotyp 1 (FAV 1): rekombinante Expression und elektronenmikroskopische Untersuchung zur Pentonbildung
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Herdecke
GCA-Verl.
1999
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Forschen und Wissen - Virologie
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 134 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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| adam_text | Titel: Die drei Pentonproteine des Hühneradenovirus Serotyp 1 (FAV 1)
Autor: Kilian, Alexandra
Jahr: 1999
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung................................................................................14
2 Ziel der Untersuchungen........................................................22
3 Material und Methoden...........................................................23
3.1 Virusmaterial und Virusantikörper.........................................................23
3.1.1 Aviäres Adenovirus Serotyp 1 (FAV-1)......................................................23
3.1.2 Baculovirus................................................................................................23
3.2 Gelelektrophorese...................................................................................23
3.2.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese..............................................................23
3.2.2 Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese..............................................24
3.2.3 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.........................25
3.2.3.1 Coomassie-Färbung..................................................................................27
3.3 Polymerase-Kettenreaktion....................................................................28
3.3.1 Amplifizierung der Pentongene mit Ziel-Plasmid-DNA
aus Bakterien zur Klonierung.....................................................................28
3.3.1.1 Durchführung der PCR mit der Taq-DNA-Polymerase...............................29
3.3.1.2 Durchführung der PCR mit der Pfu-DNA-Polymerase...............................30
3.3.1.2.1 Reinigung der Genamplifikate zur Klonierung.........................................32
3.3.2 Amplifikation der Pentongene mit Ziel-Virus-DNA aus
Insektenzellen zum Nachweis von rekombinanten Baculoviren................32
3.3.2.1 Durchführung der PCR mit der Taq-DNA-Polymerase...............................33
3.3.2.2 Durchführung der PCR mit der VentR^-DNA-Polymerase.........................33
3.3.2.3 Durchführung der PCR mit den „Ready-To-Go PCR Beads*.....................34
3.3.3 Reagenzien und Lösungen für die PCR....................................................34
3.4 DNA-Klonierung.......................................................................................35
3.4.1 Klonierung gereinigter PCR-Amplifikate in den Zwischenvektor................35
3.4.1.1 Ligationsprinzip der glatt-endigen Kionierung. Vektor und Wirtsstamm.....36
3.4.1.2 ügation......................................................................................................37
3.4.1.3 Transformation...........................................................................................37
II Inhaltsverzeichnis
3.4.2 Umklonierung klonierter Genamplifikate in den
Baculovirus-Transfervektor........................................................................38
3.4.2.1 Ligationsprinzip der überhängend-endigen Klonierung,
Vektor und Wirtsstamm.............................................................................38
3.4.2.2 Umklonierungsexperiment.........................................................................39
3.5 Arbeiten mit den rekombinanten Vektoren...........................................42
3.5.1 Identifizierung............................................................................................42
3.5.1.1 Blau-Weiß-Selektion..................................................................................42
3.5.1.2 Koloniehybridisierung................................................................................43
3.5.2 Isolierung und Vermehrung.......................................................................44
3.5.2.1 Präparation nach Birnboim und Doly.......................................................44
3.5.2.2 Präparation mit dem „Plasmid Midi Kr (Qiagen, Hilden)..........................45
3.5.2.3 Präparation nach dem „Maxi-Verfahren ...................................................46
3.5.3 Charakterisierung durch Restriktionsenzymanalyse..................................46
3.5.4 DNA-Sequenzierung der in der Restriktions-
enzymanalyse positiven Vektoren.............................................................47
3.5.4.1 Templatepräparation durch alkalische Denaturierung
(Chen und Seeburg, 1985).......................................................................47
3.5.4.2 DNA-Sequenzierungsreaktion nach Sanger.............................................47
3.5.4.2.1 Sequenzierung mit Biotin-markierten Oligonukleotiden
und Chemilumineszenz-Detektion.............................................................48
3.5.4.2.2 Sequenzierung mit ^S-markierten Didesoxy-Nukleotiden und
Autoradiographie-Detektion.......................................................................48
3.6 Zellkuttur..................................................................................................50
3.6.1 Insekten-Zellkulturen.................................................................................50
3.6.1.1 Züchtung als Einschicht-Zellkultur.............................................................50
3.6.1.2 Züchtung als Suspensionskultur................................................................51
3.6.1.3 Kryokonservierung.....................................................................................51
3.6.2 Vrtalitätskontrolle, Zellzahlbestimmung und Einstellung der Zelldichte.....53
3.6.3 Kulturmedien.............................................................................................53
3.7 Herstellung der rekombinanten Baculoviren........................................53
Inhaltsverzeichnis
3.7.1 Kotransfektion von Wildtyp-Baculovirus-DNA und
rekombinanter Transfervektor-DNA...........................................................54
3.7.1.1 Charakteristika der Wildtyp-Baculovirus-DNA............................................54
3.7.2 Isolierung rekombinanter Baculoviren........................................................55
3.7.3 Vermehrung und Titration der rekombinanten Baculoviren........................56
3.7.4 Genotypische Identifizierung der rekombinanten Baculoviren durch PCR 57
3.7.5 Erzeugung hochtitrigen Virusmaterials......................................................57
3.8 Expressionsnachweis rekombinanter Proteine....................................58
3.8.1 Western Blot..............................................................................................58
3.8.1.1 Infektion der Insektenzellen zur Proteinexpression....................................58
3.8.1.2 Zellfraktionierung zur Extraktion der rekombinanten Proteine...................59
3.8.1.3 ECL-Nachweisreaktion..............................................................................60
3.8.1.3.1 Präabsorption des Hyperimmunserum....................................................60
3.8.2 Indirekter Immunfluoreszenztest................................................................60
3.8.3 Elektronenmikroskopische Untersuchung..................................................61
3.8.3.1 Sucrosedichtegradientenzentrifugation......................................................61
3.8.3.2 Protein-Dialyse...........................................................................................62
4 Ergebnisse.............................................................................................63
4.1 Herstellung der rekombinanten Baculovirus-Transfervektoren..........63
4.1.1 PCR-Arbeiten.............................................................................................63
4.1.1.1 Konstruktion der Primer.............................................................................64
4.1.1.2 Amplifizierung der Pentongene des FAV1 zur Klonierung.........................65
4.1.2 Klonisrung der PCR-Amplifikate des FAV1 in den Zwischenvektor...........66
4.1.2.1 Identifizierung und Charakterisierung der rekombinanten
Zwischenvektoren durch Restriktionsenzymanalyse................................67
4.1.2.2 Sequenzierung der rekombinanten Zwischenvektoren..............................69
4.1.3 Umklonierung klonierter Genamplifikate des FAV1 in
den Baculovirus-Transfervektor.................................................................70
4.1.3.1 Identifizierung und Charakterisierung der rekombinanten
Baculovirus-Transfervektoren durch Restriktonsenzymanalyse................71
4.1.3.2 Sequenzierung der rekombinanten Bacuiovirus-Transfervektoren............74
IV Inhaltsverzeichnis
4.1.3.2.1 Basenfolge der PCR-Amplifikate der Pentongene des FAV1.................74
4.2 Herstellung der rekombinanten Baculoviren........................................76
4.2.1 Isolierung und Charakterisierung von rekombinanten Baculoviren...........77
4.2.2 Erzeugung hochtitrigen Virusmaterials......................................................80
4.3 Expressionsstudien der rekombinanten Pentonproteine des FAV1... 80
4.3.1 Western Blot..............................................................................................81
4.3.1.1 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
Pentonbase beinhaltet (Bac-Peba)............................................................81
4.3.1.2 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
langen Fiber beinhaltet (Bac-LoFi)............................................................83
4.3.1.3 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
langen Fiber und der Pentonbase beinhaltet (Bac-LoFi+Peba)................84
4.3.1.4 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
kurzen Fiber beinhaltet (Bac-KuFi)............................................................86
4.3.1.5 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
kurzen Fiber und der Pentonbase beinhaltet (Bac-KuFi+Peba)................87
4.3.2 Indirekte Immunfluoreszenz......................................................................89
4.3.3 Elektronenmikroskopische Untersuchungen.............................................91
4.3.3.1 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
langen Fiber und der Pentonbase beinhaltet (Bac-LoFi+Peba)................91
4.3.3.2 Ergebnisse mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz der
kurzen Fiber und der Pentonbase beinhaltet (Bac-KuFi+Peba)................92
4.3.3.3 Ergebnisse der Koinfektion mit dem Baculovirusklon, der die Gensequenz
der langen Fiber und der Pentonbase beinhaltet (Bac-LoFi+Peba), und mit
dem Baculoviruskion, der die Gensequenz der kurzen Fiber beinhaltet
(Bac-KuFi).................................................................................................92
5 Diskussion.............................................................................................94
6 Zusammenfassung.............................................................................118
7 Literaturverzeichnis........................ ................120
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