Untersuchung des homologen und illegitimen Rekombinationspotentials von Säugerzellinien:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
1999
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Beschreibung: | VI, 170, [10] S. Ill., graph. Darst. |
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adam_text | UNTERSUCHUNG DES HOMOLOGEN UND ILLEGITIMEN REKOMBINATIONSPOTENTIALS VON
SAEUGERZELLINIEN VON DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER
TECHNISCHEN UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG ZUR ERLANGUNG
DES GRADES EINER DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE DISSERTATION VON UTE PAEGELOW AUS LUEBECK INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG-. 1 1.1 GENTHERAPIE: HOFFNUNGEN,
PROBLEME UND AUSSICHTEN 1 1.2 RETROVIRALER GENTRANSFER 5 1.2.1 AUFBAU
VON RETROVIREN 5 1.2.2 LEBENSZYKLUS VON RETROVIREN 7 1.2.3
SICHERHEITSASPEKTE BEIM RETROVIRALEN GENTRANSFER 10 1.2.3.1 ENDOGENE
RETROVIRALE SEQUENZEN 13 1.2.3.2 RNA-REKOMBINATION 13 1.2.3.3
DNA-REKOMBINATION RETROVIRALER SEQUENZEN 14 1.3 DNA-REKOMBINATION 14
1.3.1 HOMOLOGE REKOMBINATION 14 1.3.1.1 AN REKOMBINATIONSVORGAENGEN
BETEILIGTE PROTEINE 17 1.3.1.2 MUTATIONEN IN ANDEREN GENEN UND FAKTOREN,
DIE DIE REKOMBI- NATIONSFREQUENZ BEEINFLUSSEN KOENNEN 19 1.3.1.3
EXTRACHROMOSOMALE REKOMBINATION 21 1.3.1.4 INTRACHROMOSOMALE UND
INTERCHROMOSOMALE REKOMBINATION 22 1.3.1.5 GENE TARGETING 23 1.3.2
ILLEGITIME (NICHT-HOMOLOGE) REKOMBINATION 25 1.3.2.1 FAKTOREN UND
ENZYME, DIE DIE FREQUENZ ILLEGITIMER REKOMBI- NATION BEEINFLUSSEN 27
1.3.2.2 SEQUENZSPEZIFISCHE REKOMBINATION 28 1.4 AUFGABENSTELLUNG 30 2.
ERGEBNISSE 31 2.1 UNTERSUCHUNGEN ZUM REKOMBINATIONSPOTENTIAL VON
ZELLINIEN 31 2.1.1 MESSUNG EXTRACHROMOSOMALER REKOMBINATION IN
VERSCHIEDENEN ZELLINIEN ... 32 2.1.1.1 TESTSYSTEM ZUR MESSUNG
EXTRACHROMOSOMALER REKOMBINATION 33 2.1.1.2 VORGEHENSWEISE ZUR MESSUNG
EXTRACHROMOSOMALER REKOMBINATION 35 2.1.1.3 BERECHNUNG DER
EXTRACHROMOSOMALEN REKOMBINATIONSFREQUENZ .... 36 2.1.1.4 AUSWAHL
GEEIGNETER ZELLINIEN 37 2.1.1.5 REKOMBINATIONSHAEUFIGKEIT DER
AUSGEWAEHLTEN ZELLINIEN 37 2.1.1.6 UNTERSUCHUNG DER AUSWIRKUNG EINER
UEBEREXPRESSION VON POLY- (ADP-RIBOSE)POIYMERASE (PARP) AUF DIE
EXTRACHROMOSOMALE REKOMBINATIONSFREQUENZ 40 2.1.2 MESSUNG DER
INTRACHROMOSOMALEN REKOMBINATION 44 .2.1 TESTSYSTEM ZUR MESSUNG
INTRACHROMOSOMALER REKOMBINATION 44 .2.2 VORGEHENSWEISE ZUR BESTIMMUNG
DER INTRACHROMOSOMALEN RE- KOMBINATIONSFREQUENZ 47 .2.3
FUNKTIONALITAETSTEST VON REKO7 49 .2.4 DER REKOMBINATIONSVEKTOR REKO8P 53
.2.5 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG AMPHOTROPER ZELLKLONE 54
2.1.2.5.1 G418-SENSITIVITAET UND PAC-EXPRESSION IN PA317-ZELL- KLONEN 55
II INHALTSVERZEICHNIS 2.1.2.5.2 VIRUSPRODUKTION DER AMPHOTROPEN
ZELLKLONE 56 2.1.2.5.3 KOPIENZAHLBESTIMMUNG VON REKO8P 56 2.1.2.5.4
INSTABILITAET VON REKO8P 57 2.1.2.6 DER REKOMBINATIONSVEKTOR REKO8HT 59
2.1.2.6.1 CHARAKTERISIERUNG AMPHOTROPER ZELLKLONE MIT REKO8HT 60 2.1.2.7
BESTIMMUNG DER INTRACHROMOSOMALEN REKOMBINATIONSFREQUENZ DES
PA317-ZELLKLONS 6.3 62 2.1.2.8 EIGENSCHAFTEN DER VERWENDETEN
VEKTORSSYSTEME ZUR UNTERSUCHUNG DES INTRACHROMOSOMALEN
REKOMBINATIONSPOTENTIALS VON ZELLINIEN . 64 2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR
STABILITAET RETROVIRALER VEKTOREN IN SAEUGERZELLEN 65 2.2.1 DELETIONEN IN
REKO8P UND REKO8HT 66 2.2.1.1 ANALYSE VON PA317-ZELLKLONEN 66 2.2.1.2
ANALYSE VON GP+E86-ZELLGEMISCHEN 72 2.2.2 EINFLUSS VON KODIERENDEN UND
REGULATORISCHEN SEQUENZEN AUF DIE INSTABILITAET RETROVIRALER VEKTOREN 75
2.2.2.1 STABILITAET VON REKO8P IN GP+E86- UND NIH3TH-ZELLGEMISCHEN.. 77
2.2.2.2 VEKTORSTABILITAET IN ABHAENGIGKEIT VON RETROVIRALEN LTRS 79
2.2.2.3 EINFLUSS EINER ZWEITEN KOPIE DES NEOMYCIN-RESISTENZGENS UND DES
IRES-EIEMENTES AUF DIE VEKTORINSTABILITAET 81 2.2.2.4 EINFLUSS DES
NEOMYCIN-RESISTENZGENS AUF DIE VEKTORINSTABILITAET.... 82 2.2.2.5
VERGLEICHENDE ANALYSE DER DELETIONEN ALLER UNTERSUCHTEN VEKTOREN , 86 3.
DISKUSSION 91 3.1 EXTRA- UND INTRACHROMOSOMALE REKOMBINATIONSFREQUENZEN
UNTERSCHIEDLICHER ZELLINIEN 91 3.1.1 HOHE EXTRACHROMOSOMALE
REKOMBINATIONSFREQUENZEN IN DEN HAMSTERZELL- LINIEN BHK-21 UND BHK-A 91
3.1.2 INTRACHROMOSOMALE REKOMBINATIONSHAEUFIGKEIT 94 3.1.2.1 GERINGE
PAC-EXPRESSION VON REKO7 INFOLGE BICISTRONISCHER EX- PRESSION UND EINES
KRYPTISCHEN SPLEISSSIGNALS 95 3.1.2.2 REKO8P-INFIZIERTE PA317-ZELLKLONE
ZEIGEN IDENTISCHE VEKTOR- DELETIONEN 95 3.1.2.3 PA317-ZELLKLONE MIT
REKO8HT: G418-RESISTENTE NICHT-VIRUS- PRODUZENTEN UND G418-SENSITIVE
VIRUSPRODUZENTEN MIT EINEM DELETIERTEN VEKTOR 96 3.1.2.4 REKO8P UND
REKO8HT: GERINGE VERPACKUNGSEFFIZIENZ DER REKOMBINATIONSVEKTOREN 98
3.1.2.5 BESTIMMUNG DER REKOMBINATIONSFREQUENZ DES PA317-ZELLKLONS 6.3 98
3.2 ILLEGITIME REKOMBINATIONSEREIGNISSE UEBERLAGERN HOMOLOGE
INTRACHROMOSOMALE REKOMBINATION 99 3.2.1 ILLEGITIME
REKOMBINATIONSEREIGNISSE FINDEN NACH CHROMOSOMALER INTEGRATION DER
VEKTOREN STATT 100 3.2.2 VEKTOREN WEISEN ORTE BEVORZUGTER ILLEGITIMER
REKOMBINATION AUF 100 3.2.3 DIE DELETIONEN KARTIEREN IN EINER KLEINEN
ANZAHL VON VEKTORSEQUENZEN ... 102 III INHALTSVERZEICHNIS 3.2.4 DAS
SEQUENZMOTIV CAAN,_,GGTG UND DER REKOMBINATIONS- HOT-SPOT .. 103 3.2.5
REKOMBINATIONS- HOT-SPOTS IN PRO- UND EUKARYOTEN 105 3.2.6
AEHNLICHKEITEN DER KONSENSUS-SEQUENZ MIT ANDEREN SEQUENZEN, DIE AN
HOMOLOGER UND NICHT-HOMOLOGER REKOMBINATION BETEILIGT SIND 106 3.2.7
KURZE DIREKTE SEQUENZWIEDERHOLUNGEN SIND CHARAKTERISTISCH FUER ILLEGITIME
REKOMBINATIONSEREIGNISSE 107 3.2.8 KURZE INSERTIONEN AN EINIGEN
FUSIONSSTELLEN 108 3.2.9 SEQUENZMOTIVE, DIE IN NICHT-LYMPHOIDEN
SAEUGERZELLEN AN DER ILLEGITIMEN REKOMBINATION BETEILIGT SIND 108 3.2.9.1
TOPOISOMERASE I ALS INITIATOR DER NICHT-HOMOLOGEN REKOMBI-
NATIONSEREIGNISSE ? 109 3.2.10 VERZICHT AUF DIE VERWENDUNG DES
SV40-EARLY-PROMOTORS FUER GEN- THERAPEUTISCHE ANSAETZE 110 3.2.11
SCHLUSSFOLGERUNGEN 110 3.2.12 AUSBLICK 111 4. PLASMIDE UND
OLIGONUKLEOTIDE 113 4.1 PLASMIDE 113 4.2 OLIGONUKLEOTIDE .117 5.
MATERIAL UND METHODEN 118 5.1 GERAETE 118 5.2 MATERIAL 119 5.2.1
AUTORADIOGRAPHIE 119 5.2.2 CHEMIKALIEN 119 5.2.3 COMPUTERPROGRAMME 120
5.3 ALLGEMEINE METHODEN 120 5.3.1 STERILISATION 120 5.3.1.1
STERILISATION DURCH HITZE 120 5.3.1.2 STERILISATION DURCH FILTRATION 120
5.3.1.3 STERILISATION DURCH DIETHYLPYROCARBONAT 120 5.3.2 PHENOLISIEREN
VON NUKLEINSAEUREN (DEPROTEINISIERUNG) 120 5.3.3 FAELLUNG VON
NUKLEINSAEUREN 121 5.3.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 121
5.3.4.1 ... SPEKTROMETRISCH 121 5.3.4.2 ... FLUOROMETRISCH 121 5.3.4.3
... ELEKTROPHORETISCH 122 5.3.5 HERSTELLUNG VON ACRYLAMID/BISACRYLAMID
122 5.4 ARBEITEN MIT E. COLI 122 5.4.1 VERWENDETE E. CO/I -STAEMME 122
5.4.2 KULTURMEDIEN 123 5.4.3 KULTIVIERUNG VON E. COLI 123 5.4.4
TRANSFORMATION VON E. COLI 123 5.4.4.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN
FUER ELEKTROTRANSFORMATION 123 5.4.4.2 ELEKTROTRANSFORMATION VON
PLASMIDEN 124 5.4.5 ANLAGE VON STAMMKULTUREN 124 5.5 ISOLIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN 124 IV INHALTSVERZEICHNIS 5.5.1 PRAEPARATION VON
PLASMID-DNA AUS E. COLI 124 5.5.1.1 ... IM ANALYTISCHEN MASSSTAB 124
5.5.1.2 ... IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB 125 5.5.1.3 ... ALS
MIDI -PLASMIDPRAEPARATION (QIAGEN) 126 5.5.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS
AGAROSEGELEN 126 5.5.2.1 ... UEBER ELEKTROELUTION 126 5.5.2.2 ... MIT
HILFE DES QIAQUICK GEL EXTRAKTIONS-KITS 127 5.5.3 ISOLIERUNG VON
HOCHMOLEKULARER DNA (HMW-DNA) AUS SAEUGERZELLEN 127 5.5.3.1
HMW-DNA-PRAEPARATION (UNTER VERWENDUNG VON PHENOL) 127 5.5.3.2 HMW-DNA
FUER SOUTHERN BLOTS ODER PCR (SCHNELLE METHODE) ... 128 5.6 MODIFIKATION
VON NUKLEINSAEUREN 129 5.6.1 RESTRIKTIONSANALYSE VON DNA 129 5.6.2
DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 130 5.6.3 AUFFUELLEN
5 -UEBERSTEHENDER ENDEN 131 5.6.4 LIGASE-REAKTION 131 5.7 RADIOAKTIVE
NACHWEISMETHODEN 132 5.7.1 MARKIERUNG VON DNA 132 5.7.1.1 RANDOM-PRIMING
MIT REDI-PRIME DNA LABELLING SYSTEM 132 5.7.1.2 KLENOW-MARKIERUNG VON
A.-DNA 132 5.7.2 SOUTHERN BLOT 133 5.7.2.1 SOUTHERN TRANSFER 133 5.7.2.2
HYBRIDISIERUNG DES SOUTHERN BLOTS 133 5.8 CHARAKTERISIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN 135 5.8.1 REVERSE TRANSKRIPTION 135 5.8.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 136 5.8.2.1 DNA-AMPLIFIKATION DURCH PCR
136 5.8.2.2 MUTAGENESE DURCH PCR 138 5.8.3 SEQUENZIERUNG VON DNA 138
5.8.3.1 ... VON PLASMID-DNA 138 5.8.3.2 ... VON PCR-FRAGMENTEN 140
5.8.3.3 ... DURCH DIE FIRMA EUROGENTEC 140 5.9 GELELEKTROPHORESEN 141
5.9.1 AGAROSE GELELEKTROPHORESE 141 5.9.2 SEQUENZIERGELE 141 5.9.2.1
HERSTELLUNG VON SEQUENZIERGELEN 141 5.9.2.2 SILANISIERUNG VON
GLASPLATTEN 142 5.9.2.3 TROCKNUNG VON POLYACIYLAMIDGELEN 142 5.9.3
VISUALISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 143 5.9.3.1 ... MIT ETHIDIUMBROMID 143
5.9.3.2 ... DURCH AUTORADIOGRAPHIE 143 5.10 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN
ZELLKULTUREN 143 5.10.1 KULTURMEDIEN UND LOESUNGEN 143 5.10.2 ZELLINIEN
144 5.10.3 KULTIVIERUNG VON ZEILINEN 145 5.10.3.1 PASSAGIEREN 145
5.10.3.2 LANGZEITLAGERUNG 145 5.10.3.3 ISOLIERUNG VON ZEILKLONEN 146
INHALTSVERZEICHNIS 5.10.4 GENTRANSFERMETHODEN 146 5.10.4.1 TRANSFEKTION
MITTELS CALCIUMPHOSPHAT-DNA-COPRAEZIPITATION ... 146 5.10.4.1.1 STABILE
EXPRESSION 146 5.10.4.1.2 TRANSIENTE EXPRESSION 148 5.10.4.2 RETROVIRALE
INFEKTION VON SAEUGERZELLEN 148 5.10.4.1.1 INFEKTION 148 5.10.4.1.2
BERECHNUNG DER INFEKTIONSMULTIPLIZITAET 150 5.11 PROTEINANALYTIK 150
5.11.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 150 5.11.2 BILDDOKUMENTATION
UND-BEARBEITUNG 151 5.11.3 VERWENDETE ANTIKOERPER 152 5.11.4 HERSTELLUNG
VON ZELLEXTRAKTEN FUER REPORTERGEN-ASSAYS 152 5.11.5
BRADFORD-PROTEINBESTIMMUNG (MIKROASSAY) 152 5.11.6 PROTEINBESTIMMUNG
MITTELS BCA-ASSAY 153 5.11.7 CAT-ELISA 153 5.11.8 PAC-ASSAY 154 6.
LITERATUR 156 VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKUERZUNGEN DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
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