Stabilität, Struktur und Funktion von Proteinen aus dem hyperthermophilen Bakterium Thermotoga maritima:
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1999
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STABILITAET, STRUKTUR UND FUNKTION VON PROTEINEN
AUS DEM HYPERTHERMOPHILEN BAKTERIUM THERMOTOGA MARITIMA
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR.
RER. NAT.) DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III - BIOLOGIE UND
VORKLINISCHE MEDIZIN -
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
DORIS WASSENBERG
REGENSBURG, 1999
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.
1.1 MIKROORGANISMEN UNTER EXTREMEN UMWELTBEDINGUNGEN 1
1.2 PROTEINE ~ 1
1.3 THERMOSTABILE PROTEINE 3
1.4 THERMOTOGA MARITIMA 5
1.4.1 DER ORGANISMUS 5
1.4.2 THERMOPHILIE VON THERMOTOGA MARITIMA 6
1.4.3 STOFFWECHSEL VON THERMOTOGA MARITIMA 7
1.5 KAELTESCHOCK UND KAELTESCHOCKPROTEINE 8
1.5.1 AENDERUNGEN IN DER UMWELT 8
1.5.2 DAS KAELTESCHOCKPROTEIN AUS THERMOTOGA MARITIMA 9
1.6 PERIPLASMATISCHE BINDEPROTEINE UND TRANSPORTSYSTEME 10 1.6.1
MODELLSYSTEM: ECMBP AUS E.COLI 11
1.6.1.1 MALTOSE/MALTODEXTRIN-TRANSPORTSYSTEM UND CHEMOTAXIS 11
1.6.1.2 ECMBP: SUBSTRATSPEZIFITAET 11
1.6.1.3 ECMBP: STRUKTUR 12
1.6.1.4 STABILITAET UND THERMODYNAMIK 13
1.6.2 TCMBP AUS THERMOCOCCUS LITORALIS 13
1.7 PGK-TEVI-FUSIONSPROTEIN 14
1.8 PROTEASEN IN HYPERTHERMOPHILEN ORGANISMEN 17
2 PROBLEMSTELLUNG 18
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 20
3.1 KAELTESCHOCKPROTEIN (CSP) 20
3.1.1 REINIGUNG 20
3.1.2 THERMODYNAMISCHE CHARAKTERISIERUNG MITTELS DSC 21
3.1.2.1 REVERSIBILITAET, SOWIE UNABHAENGIGKEIT VON HEIZRATE UND
KONZENTRATION 21 3.1.2.2 ZWEI-ZUSTANDS-MODELL 21
3.1.2.3 BESTIMMUNG DER PARTIELLEN MOLAREN WAERMEKAPAZITAET 22
3.1.2.3.1 ACP-BESTIMMUNG AUS EINZELMESSUNGEN 22
3.1.2.3.2 PH-ABHAENGIGKEIT UND PROTEINIONISATION 24
3.1.2.3.3 ENTHALPIEAENDERUNG BEI DER ENTFALTUNG 26
3.1.2.3.4 AC P VON CSP 28
3.1.2.4 FREIE ENTHALPIE DER STABILISIERUNG 29
3.1.2.4.1 BERECHNUNG DER FREIEN ENTHALPIE DER STABILISIERUNG VON CSP 29
3.1.2.4.2 VERGLEICH MIT BEKANNTEN DATEN VON CSP AUS THERMOTOGA MARITIMA
31 3.1.2.4.3 VERGLEICH MIT ANDEREN PROTEINEN (PH 7) UND STABILISIERUNG
DURCH SSDNA- BINDUNG 32
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 MALTOSE-BINDENDES PROTEIN (MBP) 35
3.2.1 SEQUENZ 35
3.2.2 PRAEPARATION DER PROTEINE 37
3.2.2.1 REINIGUNG VON NATUERLICHEM MBP AUS THERMOTOGA MARITIMA (TMMBP) 37
3.2.2.2 EXPRESSION UND REINIGUNG VON REKOMBINANTEM MBP 38
3.2.2.2.1 PERIPLASMATISCHE EXPRESSION 38
3.2.2.2.2 CYTOSOLISCHE EXPRESSION 38
3.2.2.3 MUTANTE C8S 40
3.2.3 VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG VON TMMBP, WTMBP, MMBP 40 3.2.3.1
MOLEKUELMASSE, ASSOZIATIONSGRAD UND N-TERMINUS 41
3.2.3.2 SPEKTROSKOPISCHE EIGENSCHAFTEN 42
3.2.3.2.1 ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE 42
3.2.3.2.2 FLUORESZENZEMISSION 43
3.2.3.2.3 ZIRKULARDICHROISMUS (CD) 43
3.2.3.3 ZUCKERBINDUNG 44
3.2.3.4 STABILITAET 44
3.2.3.4.1 SCHMELZKURVEN 44
3.2.3.4.2 GDMCL-INDUZIERTE RENATURIERUNG 44
3.2.4 BINDUNG VON SACCHARIDEN 46
3.2.4.1 MALTOSEBINDUNG 46
3.2.4.1.1 EINFLUSS AUF SPEKTROSKOPISCHE EIGENSCHAFTEN 46
3.2.4.1.2 FLUORESZENZTITRATION UND TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER
MALTOSEBINDUNG 48 3.2.4.1.3 BESTIMMUNG DES K D DURCH ANALYTISCHE
GELFILTRATION 50
3.2.4.1.4 ZAHL DER BINDUNGSPLAETZE: TITRATION BEI HOEHERER
PROTEINKONZENTRATION 51 3.2.4.2 SUBSTRATSPEZIFITAET 53
3.2.4.3 EXTRINSISCHE STABILISIERUNG VON MBP DURCH MALTOSE 55
3.2.5 STABILITAET 56
3.2.5.1 LANGZEITSTABILITAET BEI LOESUNGSMITTELVARIATION 56
3.2.5.1.1 IONENSTAERKE 56
3.2.5.1.2 PH 56
3.2.5.2 THERMISCHE STABILITAET 58
3.2.5.2.1 LANGZEITSTABILITAET UND ARTEFAKTBILDUNG 58
3.2.5.2.2 SCHMELZKURVEN (CD, UV, DSC) 58
3.2.5.2.3 FALSCH GEFALTETE SPEZIES 60
3.2.5.3 GUANIDINIUMCHLORID-INDUZIERTE ENT- UND RUECKFALTUNG 62
3.2.5.3.1 ENTFALTUNG IN GDMCL 62
3.2.5.3.2 REVERSIBILITAET 62
3.2.5.3.3 GLEICHGEWICHT VON DE- UND RENATURIERUNGSUEBERGAENGEN 62
3.2.5.3.4 RENATURIERUNG 64
3.2.5.3.5 AUSWERTUNG 64
3.2.6 3D-STRUKTUR 67
3.2.6.1 KRISTALLISATION 67
3.2.6.2 MODELL 68
INHALTSVERZEICHNIS
3.3 PGK-TIM FUSIONSPROTEIN 69
3.3.1 GESAMTMASSE VON PGK-TIM 69
3.3.2 MASSE VON PROTEOLYTISCH ERZEUGTEN FRAGMENTEN VON PGK-TTM (*PEPTIDE
MAPPING ) 70
3.4 NACHWEIS EINER ATP-ABHAENGIGEN PROTEASE IN T. MARITIMA 76
3.4.1 AKTIVITAETSTEST-VORVERSUCHE MIT TRYPSIN 76
3.4.2 VERSUCH DER ISOLIERUNG EINER ATP-ABHAENGIGEN PROTEASE 77
3.4.3 EINFLUSS VON IONEN UND AUFBEWAHRUNGSTEMPERATUR AUF DIE STABILITAET
UND AKTIVITAET DER ATP-ABHAENGIGEN PROTEASE ; 80
3.4.4 EINFLUSS VON PROTEASE-INHIBITOREN 80
3.4.5 SEQUENZANALYSEN 81
3.4.6 WESTERN BLOT MIT PROTEASE LA-ANTIKOERPERN 81
4 ZUSAMMENFASSUNG..... .82
S MATERIALIEN UND METHODEN.. .86
S.L MATERIALIEN .86
5.1.1 CHEMIKALIEN 86
5.1.2 STANDARDS UND KITS 87
5.1.3 ENZYME UND PROTEINE 87
5.1.4 BAKTERIENSTAEMME 87
5.1.5 PLASMIDE UND OLIGODESOXYNUKLEOTIDE 87
5.1.6 ALLGEMEINE LOESUNGEN 88
5.1.7 SONSTIGE MATERIALIEN 90
5.1.8 GERAETE 91
5.1.9 COMPUTERPROGRAMME 92
5.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 93
5.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 93
5.2.2 MUTAGENESE 93
5.2.3 RESTRIKTIONSVERDAU 93
5.2.4 GELELEKTROPHORESE VON DNA 93
5.2.5 SEQUENZIERUNG VON DNA 94
5.2.6 TRANSFORMATION VON E. COLI 94
5.2.7 ANZUCHT UND KONSERVIERUNG VON E. COLI STAEMMEN 94
5.2.8 PLASMIDSTABILITAETSTEST 94
5.2.9 EXPRESSIONSTEST 95
5.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 95
5.3.1 ANZUCHT UND EXPRESSION 95
5.3.1.1 ANZUCHT VON THERMOTOGA MARITIMA UND HERSTELLUNG DES ROHEXTRAKTS
95 5.3.1.2 EXPRESSION IN E. COLI UND HERSTELLUNG DES ROHEXTRAKTS 95
5.3.2 PROTEINREINIGUNG: CHROMATOGRAPHIE 96
5.3.3 SDS-PAGE 98
5.3.4 NATIV-PAGE UND ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 98
5.3.5 FAERBUNG VON PROTEINGELEN UND BLOTTING 98
5.3.6 MOLEKULARMASSE UND ASSOZIATIONSGRAD 100
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.6.1 ANALYTISCHE GELFILTRATION 100
5.3.6.2 ANALYTISCHE ULTRAZENTRIFUGATION 100
5.3.6.3 HOCHDRUCK-FLUESSIGKEITS-CHROMATOGRAPHIE UND
ESI-MASSENSPEKTROMETRIE (HPLC- MS) 101
5.3.7 SPEKTROSKOPIE 101
5.3.7.1 UV-ABSORPTION 101
5.3.7.2 FLUORESZENZEMISSION 101
5.3.7.3 ZIRKULARDICHROISMUS (CD) 102
5.3.8 SACCHARIDBINDUNG VON MBP 103
5.3.9 AKTIVTTAETSTESTS FUER PROTEASEN 104
5.3.9.1 AKTIVITAETSTEST MIT AZOCASEIN 104
5.3.9.2 AKTIVITAETSTEST MIT FLUOROGENEN SUBSTRATEN 105
5.3.9.3 AKTIVITAETSTEST MIT ROENTGENFILM 105
5.3.9.4 ZYMOGRAMM 105
5.3.10 STABILITAET 106
5.3.10.1 LANGZEITSTABILITAET UND CHEMISCHE DENATURIERUNG 106
5.3.10.1.1 IONENSTAERKE 106
5.3.10.1.2 PH 106
5.3.10.1.3 GUANIDINIUMCHLORID-INDUZIERTE GLEICHGEWICHTSUEBERGAENGE 106
5.3.10.1.4 RUECKSPRUNGEXPERIMENTE 107
5.3.10.2 THERMISCHE DENATURIERUNG 107
5.3.10.2.1 LANGZEITSTABILITAET 107
5.3.10.2.2 SCHMELZKURVEN IN CD UND UV-ABSORPTION 107
5.3.10.2.3 DIFFERENTIAI SCANNING CALORIMETRY (DSC) 108
5.3.11 KRISTALLISATION 110
5.3.12 MASSENSPEKTROMETRIE 110
5.3.12.1 PROBENVORBEREIRUNG 1
5.3.12.2 MALDI-MS 111
5.3.12.3 ESI-MS 112
5.3.12^4 TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE (MS/MS) 112
6 ANHANG 113
6.1 ABKUERZUNGEN 113
6.2 PUBLIKATIONEN 116
6.3 LITERATUR 117
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