Charakterisierung des retroviralen Infektionsblocks in hämatopoetischen Stammzellinien und Strategien zu seiner Überwindung:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
1.
EINLEITUNG
S
1.1.
GENTHERAPIE
IN
HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLEN
5
1.1.1.
DAS
HAEMATOPOETISCHE
SYSTEM
5
1.2.
GENTRANSFERMETHODEN
8
1.2.1.
DIE
RETROVIREN
9
1.2.1.1.
DER
RETRO
VIRALE
LEBENSZYKLUS
DES
MAUS-LEUKAEMIE-VIRUS
10
1.2.1.1.1.
ANLAGERUNG
UND
AUFNAHME
10
1.2.1.1.2.
REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
KEMEINTRITT
12
1.2.1.1.3.
INTEGRATION,
TRANSKRIPTION
UND
TRANSLATION
13
1.2.1.1.4.
VERPACKUNG,
KNOSPUNG
UND
REIFUNG
14
I.2.I.2.
EINTEILUNG
DER
MAUS-LEUKAEMIE-VIREN
16
1.2.1.2.1.
VERGLEICH
VON
10A1
UND
AMPHOTROPEN
MLV
UND
IHREN
REZEPTOREN
17
1.2.2.
RETROVIRALE
VEKTOREN
UND
VERPACKUNGSZELLINIEN
AUF
DER
BASIS
VON
MLV
18
1.2.3.
PSEUDOTYPVEKTOREN
20
1.3.
PROBLEMSTELLUNG
22
1.4.
ZIELSETZUNG
24
2.
MATERIAL
2$
2.1.
ZELLKULTUR
25
2.1.1.
CHEMIKALIEN
25
2.1.2.
ZELLINIEN
26
2.1.3.
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
27
2.1.4.
GERAETE
29
2.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHES
MATERIAL
29
2.2.1.
CHEMIKALIEN
29
2.2.2.
ENZYME
30
2.2.3.
PLASMIDE
30
2.2.4.
PRIMER
31
2.2.5.
LOESUNGEN
32
2.2.6.
BAKTERIENSTAEMME
36
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.7.
KITS
UND
MEMBRANEN
36
2.2.8.
GERAETE
37
2.3.
PROTEINCHEMISCHES
MATERIAL
37
2.3.1.
CHEMIKALIEN
37
2.3.2.
PEPTIDE
37
2.3.3.
LOESUNGEN
38
2.3.4.
KITS,
MEMBRANEN
UND
FILME
41
2.3.5.
GERAETE
41
3.
METHODEN
42
3.1.
ZELLKULTUR
42
3.1.1.
ZELLKULTURBEDINGUNGEN
42
3.1.2.
CALCIUMPHOSPHATTRANSFEKTION
42
3.1.3.
BESTIMMUNG
DES
VIRUST
ITERS
43
3.1.3.1.
GTU-ASSAY
(VIRUSTITERBESTIMMUNG)
43
3.1.3.2.
BESTIMMUNG
DER
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
43
3.1.4.
HERSTELLUNG
DER
VERPACKUNGSZELLINIEN
FUER
DIE
MLV(VSV)-
44
PSEUDOTYPVEKTOREN
3.1.5.
SYNZYTHIEN-ASSAY
45
3.1.6.
VIRUSBINDUNGS-ASSAY
46
3.1.7.
TUMKAMYCINBEHANDLUNG
DER
ZELLEN
47
3.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
49
3.2.1.
RNA
ANALYSEN
49
3.2.1.1.
RNA
PRAEPARATION
AUS
GEWEBEKULTURZELLEN
49
3.2.1.2.
RNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
49
3.2.1.3.
NORTHERN
TRANSFER
50
3.2.I.4.
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
50
3.2.I.5.
NORTHERN
HYBRIDISIERUNG
51
3.2.2.
C-DNA-SYNTHESE
52
3.2.3.
POLYMERASE
KETTENREAKTION
52
3.2.3.1.
NESTEDPCR
54
3.2.4.
KLONIERUNGSTECHNIKEN
55
3.2.4.1.
DNA-HYDROLYSE
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
55
3.2.4.2.
GLAETTEN
UEBERSTEHENDER
DNA-ENDEN
55
IN
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.43.
AGARO
SEGELELEKTROPHORESE
56
3.2.4.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
56
3.2.4.5.
DEPHOSPHORYLIERUNG
57
3.2.4.6.
LIGATION
57
3.2.4.7.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI-STAEMME
57
3.2.5.
DNA-MINI-PRAEPARATION
58
3.2.6.
DNA-MAXI-PRAEPARATION
59
3.2.7.
SEQUENZIERUNG
60
3.3.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
61
3.3.1.
ANTISERUMPRODUKTION
61
3.3.1.1.
IMMUNISIERUNG
DER
KANINCHEN
61
3.3.1.2.
DOT-BLOTS
62
3.3.I.3.
UEBEREXPRESSION
DES
ANTIGENS
IN
BAKTERIEN
62
3.3.2.
ZELLEXTRAKTE
63
3.3.3.
WESTEMBLOT-ANALYSEN
63
3.3.3.1.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
63
3.3.3.2.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
64
33.3.3.
COOMASSIE-FAERBUNG
65
33.3.4.
WESTERN-TRANSFER
65
33.3.5.
IMMUNOLOGISCHER
PROTEINNACHWEIS
65
33.3.6.
KOMPETETIERUNGS
ANALYSEN
67
33.3.7.
REINIGUNG
DER
ANTISEREN
67
3.3.3.73.
REINIGUNG
UEBER
KOPPLUNG
AN
DAS
UEBEREXPRIMIERTE
PEPTID
68
33.3.7.2.
REINIGUNG
UEBER
AFLI-GEL
15
68
4.
ERGEBNISSE
70
4.1.
TRANSDUKTIONSVERSUCHE
AN
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
70
4.1.1.
TRANSDUKTION
VON
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
MIT
70
RETROVIRALEN
VEKTOREN,
DIE
VON
AMPHOTROPEN
MLV-VERPACKUNGSZELLINIEN
STAMMEN
4.1.2.
TRANSDUKTION
VON
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
MIT
73
RETROVIRALEN
VEKTOREN,
DIE
VON
10A1
MLV-VERPACKUNGSZELLINIEN
STAMMEN
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.3.
TRANSDUKTION
VON
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
MIT
MLV(VSV)-PSEUDOTYPEN
77
4.2.
SYNZYTHIEN-ASSAY
MIT
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
79
4.2.1.
SYNZYTHIEN-ASSAY
MIT
DER
AMPHOTROPEN
P2E'
VIRUSMUTANTE
80
4.2.2.
SYNZYTHIEN-ASSAY
MIT
DER
10A1
P2E*
VIRUSMUTANTE
83
4.2.3.
SYNZYTHIEN-ASSAY
MIT
DER
ECOTROPEN
P2E
'
VIRUSMUTANTE
85
4.3.
ANALYSE
DER
VIRUSBINDUNG
AN
HAEMATOPOETISCHE
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
MIT
HILFE
DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
88
4.3.1.
ETABLIERUNG
DER
METHODE
88
4.3.2.
AMPHOTROPES
UND
10A1-MLV
WERDEN
VON
VERSCHIEDENEN
ANTIKOERPERN
ERKANNT
92
4.3.3.
ADSORPTION
VON
AMPHOTROPEN
MLV
AN
HAEMATOPOETISCHE
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
94
4.3.4.
ADSORPTION
VON
10A1-MLV
AN
HAEMATOPOETISCHE
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
98
4.4.
NORTHEMBLOT-ANALYSE
101
4.5.
INFEKTIONSVERSUCHE
MIT
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLINIEN
UND
FIBROBLASTEN
NACH
VORBEHANDLUNG
DER
ZELLEN
MIT
TUNIKAMYCIN
102
4.6.
STUDIEN
AUF
PROTEINEBENE
103
4.6.1.
ANALYSE
DER
ANTISEREN
MIT
HILFE
VON
DOT-PLOTS
104
4.6.2.
SPEZIFITAET
DER
ANTISEREN
106
4.6.2.1.
KLONIERUNG
DER
UEBEREXPRESSIONSPLASMIDE
106
4.6.2.2.
WESTEMBLOT-ANALYSEN
MIT
PIT
1
/
PIT-2
UEBEREXPRIMIERTEN
PROTEINEN
107
4.6.3.
WESTEMBLOT-ANALYSE
DER
PROTEINEXTRAKTE
VON
FIBROBLASTEN
UND
HAEMATOPOETISCHEN
STAMM
UND
VORLAEUFERZELLEN
108
4.6.4.
KOMPETETIERBARKEIT
DER
MIT
DEM
SERUM
REAGIERENDEN
PROTEINBANDE
111
4.6.5.
REINIGUNG
DER
ANTISEREN
113
4.6.5.1
REINIGUNG
DES
ANTISERUMS
UEBER
KOPPLUNG
AN
DAS
UEBEREXPRIMIERTE
PROTEIN
UND
DESSEN
KOMPETETIERBARKEIT
113
4.6.S.2.
REINIGUNG
DES
ANTISERUMS
UEBER
AFFI-GEL
15
UND
DESSEN
KOMPETETIERBARKEIT
114
5.
DISKUSSION
117
5.1.
DIE
HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLINIEN
FDC-PMIX
SIND
EIN
GUTES
MODELL
ZUR
ANALYSE
DES
RETROVIRALEN
INFEKTIONSBLOCK
PRIMAERER
HAEMATOPOETISCHER
STAMMZELLEN
117
V
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.
UEBERWINDUNG
DES
TRANSDUKTIONSBLOCK
VON
HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLINIEN
119
5.3.
CHARAKTERISIERUNG
DES
TRANSDUKTIONSBLOCKS
VON
HAEMATOPOETISCHEN
122
STAMMZELLINIEN
5.4.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
127
5.5.
AUSBLICK
127
6.
LITERATUR
129
I.
ANHANG |
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