Genetische und funktionelle Analyse der Superantigen-Reaktivität polymorpher V-Segmente der T-Zellrezeptor-Beta-Kette in der Ratte:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG .1
2. MATERIAL UND METHODEN .14
2.1. MATERIAL .14
2.1.1. VERSUCHSTIERE.14
2.1.2. ZELLEN .14
2.1.3. BAKTERIENSTAEMME .15
2.1.4. BAKTERIELLE TOXINE .15
2.1.5. VEKTOREN .16
2.1.6. SEROLOGISCHE REAGENZIEN .18
2.1.7. OLIGONUKLEOTIDE .18
2.1.8. STANDARDS UND KITS .,.20
2.1.9. ENZYME UND INHIBITOREN .20
2.10. CHEMIKALIEN.21
2.11. STANDARDLOESUNGEN, PUFFER UND MEDIEN .23
2.1.12. GERAETSCHAFTEN .26
2.2. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN .27
2.2.1. KULTIVIEREN VON ZELLEN .27
2.2.2. EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN .27
2.2.3. PRAEPARATION VON EINZELZELLSUSPENSIONEN .27
2.2.4. IMMUNFLUORESZENZANALYSE UND DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS) .28
2.2.5. ANREICHERUNG VON ZELLPOPULATIONEN .30
2.2.5.1. REINIGUNG VON T-ZELLEN DURCH NYLONWOLLPASSAGE .30
2.2.5.2. ANREICHERUNG UND STIMULATION VON ZELLEN DURCH IMMOBILISIERTE,
TER SPEZIFISCHE MAK (PANNING).30
2.2.5.3. ANREICHERUNG DURCH FLUORESZENZAKTIVIERTE ZELLSORTIERUNG
(FACSORT).30
2.2.6.
IN
V/RRO-STIMULATION VON LYMPHATISCHEN ZELLEN.31
2.2.6.1. STIMULATION MIT IMMOBILISIERTEN, TER SPEZIFISCHEN MAK.31
2.2.6.2. STIMULATION MIT CD3 SPEZIFISCHEM AK .32
2.2.6.3. STIMULATION MIT BAKTERIELLEN SUPERANTIGENEN (SEB, SEC1, MAS).32
2.2.6.4. STIMULATION MIT BASISCHEM MYELINPROTEIN (MBP) .32
2.2.6.5. STIMULATION MIT CONCANAVALIN A .33
2.2.7. BESTIMMUNG DER IL-2 MENGE IN ZELLKULTURUEBERSTAENDEN.33
2.2.8. HERSTELLUNG VON HYBRIDOMEN DURCH ZELLFUSION.33
2.2.9. EINZELZELLKLONIERUNG DURCH GRENZVERDUENNUNG ("LIMITING
DILUTION").34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.3. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN .35
2.3.1. GELELEKTROPHORESE .35
2.3.2. ELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN .35
2.3.3. RESTRIKTIONSSPALTUNGEN.36
2.3.4. ISOLATION VON GESAMT-RNA .36
2.3.4.1. UEBER ULTRAZENTRIFUGATION DURCH EIN CSCL-KISSEN.36
2.3.4.2. DURCH SAURE PHENOLEXTRAKTION .36
2.3.4.3. RNEASY-KIT (QUIAGEN) .37
2.3.5. ISOLATION VON DNA .37
2.3.5.1. GENOMISCHE DNA AUS GEWEBE.37
2.3.5.2. PLASMID-DNA .37
2.3.5.2.1. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB.38
2.3.5.2.1.1. MIT LICL-PRAEZIPITATION .38
2.3.5.2.1.2. QUIAGEN-MAXIKIT .38
2.3.5.2.2. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN MASSSTAB.39
2.3.5.2.2.1. DURCH ALKALISCHE LYSE .;.39
2.3.5.2.2.2. UEBER PROMEGASAEULEN .39
2.3.6. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) .40
2.3.6.1. STANDARD-PCR.40
2.3.6.2. RT-PCR .41
2.3.6.3. REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN.41
2.3.7. KLONIERUNGEN .42
2.3.7.1. VORBEREITEN DES VEKTORS . 42
2.3.7.2. VORBEREITEN DES INSERTS.42
2.3.7.3. LIGATION .42
2.3.7.4. TRANSFORMATION.43
\
2.3.7.5. BLUNT END-KLONIERUNGEN VON PCR-PRODUKTEN .43
2.3.7.6. UMKLONIEREN IN DEN VIRALEN EXPRESSIONSVEKTOR SFG .45
2.3.8. SEQUENZIEREN VON DNA.45
2.3.9. RNASE-PROTEKTIONSASSAY .46
2.3.19. GERICHTETE MUTAGENESE MITTELS OVERLAP-EXTENSION-PCR .47
2.3.11. TRANSDUKTION VON GENEN IN EUKARYOTISCHE ZELLEN DURCH VIRALE
VEKTOREN . .49
3. ERGEBNISSE .53
3.1. STAMMSPEZIFISCHE UNTESCHIEDE IN DER ANTWORT VON R78 POSITIVEN
ZELLEN AUF SUPERANTIGENE 53
3.2. IDENTIFIZIERUNG VON
TCRB-V8.2 UND - V8.4 ALLELEN IN LEW UND DA.56
3.3. ANALYSE DER EXPRESSION VON TCRB-V8.2 UND-V8.4 MRNA MITTELS
RNASE-PROTEKTIONSASSAY S.58
3.3.1. UNTERSCHIEDE ZWISCHEN DA UND LEW IN DER EXPRESSIONSSTAERKE VON
TCRB-V8.2
UND - V8.4 MRNA IM THYMUS.59
3.3.2. ZELLEN, DIE DAS R78-EPITOP TRAGEN, EXPRIMIEREN TCRB-V8.2' UND
TCRB-V8.4
A, NICHT ABER TCRB-V8.2A.61
3.3.3. TCRB-V8.2- UND TCRB-V8.4-ALLELE ZEIGEN UNTERSCHIEDLICHE
SAG-REAKTIVITAET.65
3.4. MOEGLICHE KORRELATION ZWISCHEN SAG-REAKTIVITAET UND DER
AMINOSAEURESEQUENZ IN
CDR2 UND CDR4 DER TER SS-KETTE.67
3.5. UNTERSUCHUNG DER ROLLE VON CDR2 UND CDR4 BEI DER AKTIVERUNG DURCH
SAG .67
3.5.1 GENERIERUNG UND ANALYSE TCRB-V8.2' EXPRIMIERENDER HYBRIDOME.68
3.5.2. IDENTIFIERUNG DER TER A- UND SS-KETTE DES HYBRIDOMS 35/1 MITTELS
RT-PCR.72
3.5.2.1. TER A-KETTE .72
3.5.2.2. TER SS-KETTE .74
3.5.3. IDENTIFIZIERUNG DER TCR-SEQUENZEN DER HYBRIDOME 35/3,53/4, 53/7
UND 77/10.77
3.6. EXPRESSION DES MBP-SPEZIFISCHEN, SEB-REAKTIVEN TER IN
EUKARYOTISCHEN ZELLEN MITTELS
RETROVIRALER VEKTOREN .78
3.6.1. UMKLONIEREN DER TER A- UND SS-KETTENGENE DES HYBRIDOMS 33/1 IN
EINEN
EXPRESSIONSVEKTOR.78
3.6.2. TRANSDUKTION DER ZELLINIE 4G4 MIT SFG-S65T, SFG-TCRA-35/1 UND
SFG-TCRB-35/1 .79
3.6.3. TRANSDUKTION DER ZELLINIE BW58 MIT SFG-S65T, SFG-TCRA-35/1 UND
SFG-TCRB-35/1 .79
3.6.4. ANALYSE DES UNBEKANNTEN TER IN 4G4 UND BW58 NACH ALLEINIGER
TRANSDUKTION MIT SFG-TCRB-3571 .81
3.6.5. STIMULATIONSBEDINGUNGEN FUER TCR-TRANSDUZIERTE BW58 .84
3.7. GERICHTETE MUTAGENESE DER POTENTIELL SAG-BINDENDEN BEREICHE VON
TCRB-V8.2* UND
EXPRESSION DER MUTIERTEN TER IN BW58 .86
3.8. FUNKTIONALITAETSTEST DER MUTIERTEN TER.87
3.9. STIMULATION DER KLONE MIT MUTIERTER SS-KETTE MIT DEM SAG MAS.,.87
3.10. KOTRANSDUKTION VON CD4 UND SFG-TCRB-35/1 IN SFG-TCRA-35/1
TRANSDUZIERTE BW58 . .91
3.11. TEST DER AG-SPEZIFITAET UND SAG-REAKTIVITAET NACH KOTRANSDUKTION VON
SFG-TCR-35/1
UND CD4 .92
4. DISKUSSION .95
5. ZUSAMMENFASSUNG . 107
6. LITERATURVERZEICHNIS .109
7. ABKUERZUNGEN
117 |
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